負(fù)載口蹄疫病毒VP1抗原的樹突狀細(xì)胞啟動(dòng)的T細(xì)胞應(yīng)答.pdf

1、口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(FMD virus,FMDV)引起的偶蹄動(dòng)物的一種急性、高度接觸性、發(fā)熱性傳染病。FMDV衣殼由4種結(jié)構(gòu)蛋白VP1,VP2,VP3,VP4各60個(gè)拷貝組成。研究表明,結(jié)構(gòu)蛋白VP1富含T細(xì)胞抗原表位與B細(xì)胞抗原表位,是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要成分,同時(shí)還是被宿主細(xì)胞識別的主要病原體相關(guān)模式分子,在免疫應(yīng)答中發(fā)揮著主要作用。樹突狀細(xì)胞(dendritic cell

2、s,DCs)是功能最強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC),通過其吞噬受體或模式識別受體捕獲抗原,并將其提呈給T細(xì)胞,它能夠調(diào)節(jié)機(jī)體對病原體的免疫應(yīng)答,但目前還不清楚它在抗FMDV感染中的作用。
　　 實(shí)驗(yàn)證明,FMDV野毒株并不感染DC,但在培養(yǎng)基上馴化的FMDV則可以感染DC,并且與抗體結(jié)合后的FMDV也可感染DC,導(dǎo)致其抗原提呈功能喪失,而當(dāng)DC負(fù)載滅活FMDV免疫復(fù)合物后卻能夠有

3、效地刺激T細(xì)胞。眾所周知,細(xì)胞免疫應(yīng)答在抗病毒感染過程中發(fā)揮重要作用。被DC活化的T細(xì)胞在IL-12的作用下,可分化為Thl細(xì)胞,介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答并產(chǎn)生調(diào)理性抗體(IgG),從而清除胞內(nèi)病原體感染。而在IL-4的作用下,有利于Th細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化,介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答,產(chǎn)生中和抗體,清除外周循環(huán)中的病原體。目前尚不清楚DC啟動(dòng)細(xì)胞免疫應(yīng)答的機(jī)制。
　　 本研究選用VP1進(jìn)行原核表達(dá),用純化后的VP1負(fù)載DC,再與淋巴結(jié)T細(xì)胞進(jìn)行

4、共培養(yǎng),通過ELISA檢測共培養(yǎng)物上清中IFN-γ和IL-4的水平,從而研究其免疫應(yīng)答機(jī)制以及DC提呈FMDV VP1抗原的途徑。
　　 試驗(yàn)以重組質(zhì)粒pUC57-VP1為模板,經(jīng)過NcoⅠ-HF和XhoⅠ雙酶切得到FMDV的VP1基因,再以相同的限制性酶對原核表達(dá)載體pET32a(+)進(jìn)行消化,通過T4 DNA連接酶連接二者,并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到宿主菌DH5α中去,得到重組質(zhì)粒pET32a(+)-VP1,再將新得到的重組質(zhì)粒pE

5、T32a(+)-VPl轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21(DE3)中去,經(jīng)酶切鑒定以及基因序列測定。結(jié)果表明,VP1基因定向連接到原核表達(dá)載體pET32a(+)上。將VP1基因與GenBank發(fā)表的序列進(jìn)行同源性比較,證明本研究所用的基因序列與Foot-and-mouth disease virus O isolate O／NYOO基因編碼序列(NCBI登陸號為AY333431.1)同源性最高,可達(dá)100％。結(jié)果證明pET32a(+)-VP1重組表達(dá)

6、菌構(gòu)建成功。為鑒定pET32a(+)-VP1基因能否在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),研究者對重組表達(dá)菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),同時(shí)以相同的條件對空載體pET32a(+)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),用來作為陰性對照。SDS-PAGE電泳以及Western-blotting檢測結(jié)果顯示,在分子量約為43kDa處有一條明顯的蛋白條帶,而空載體pET32a(+)在相應(yīng)的位置卻未見此特異性蛋白條帶。為了驗(yàn)證負(fù)載FMDV VP1的DC能否有效地激活淋巴結(jié)T細(xì)胞,用負(fù)載FMDVVP1