負載口蹄疫病毒VP1-VP4融合蛋白質(zhì)的樹突狀細胞啟動的T細胞應(yīng)答.pdf

1、分類號：墨墨55：魚5窆：魚密級：公玨單位代碼：學(xué)號：100862009490負載口蹄疫病毒VP1一VP4融合蛋白質(zhì)的樹突狀細胞啟動的T細胞應(yīng)答TcellresponsestriggeredbydendriticcellspulsedwithVPlVP4fusionproteinoffootandmouthdiseasevirus學(xué)位申請人：指導(dǎo)教師：學(xué)科專業(yè)：學(xué)位類別：授予單位：答辯日期：李娜王家鑫教授預(yù)防獸醫(yī)學(xué)農(nóng)學(xué)碩士河北農(nóng)業(yè)大學(xué)二

2、。一二年五月二十六日摘要口蹄疫(footandmouthdisease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(FMDvirus，F(xiàn)MDV)感染偶蹄獸所引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。目前本病尚無有效的預(yù)防控制措施。FMDV衣殼由VPl、VP2、VP3和VP4四種結(jié)構(gòu)蛋白組成，其中VPl為主要抗原位點，含豐富的T、B抗原表位，VP4雖位于衣殼內(nèi)部，相對比較保守，也富含T抗原表位。實驗證明，F(xiàn)MDV野毒株并不感染DCs，但在培養(yǎng)基上馴化的FMDV

3、則可以感染DCs。尤其是被抗體IgG調(diào)理的FMDV，不僅可以感染DCs，導(dǎo)致其抗原提呈功能喪失，而且還造成DCs大量死亡，而當DCs負載滅活FMDV免疫復(fù)合物后卻能夠有效地刺激T細胞。因此，人們開始重視機體對FMDV細胞免疫應(yīng)答的機制研究。樹突狀細胞(Dendriticcells，DCs)是啟動細胞免疫應(yīng)答的專職抗原提呈細胞，可通過巨吞飲、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞和吞噬三種方式攝取外源性抗原，經(jīng)過多種抗原提呈途徑啟動細胞免疫應(yīng)答。目前尚不清楚DC

4、s攝取FMDV抗原的方式以及DCs負載FMDV抗原后啟動細胞免疫應(yīng)答的機制。本研究以重組質(zhì)粒pUC57VPl為模板，通過PCR方法改變VPl一端的酶切位點，然后通過NcoI和BamHI位點將VPl基因插入到原核表達載體pET32a()，構(gòu)建pET32aVPl。然后用XhoI和BamH1分別對pBluescriptIISK()VP4和pET32aVPl進行雙酶切，構(gòu)建pET32aVPlVP4。將構(gòu)建的pET32a。VPl一VP4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)

5、化表達宿主菌BL21(DE3)，進行誘導(dǎo)表達。通過對誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化，根據(jù)SDSPAGE確定目的蛋白的最佳表達條件，利用載體的HisTag標簽和FMDV陽性血清分別進行Westemblot鑒定。本研究構(gòu)建的原核表達系統(tǒng)pET32aVPl一VP4經(jīng)酶切和測序鑒定，證明pET32aVPlVP4構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)后經(jīng)誘導(dǎo)表達和誘導(dǎo)條件優(yōu)化，在分子量約為49kD處有一條明顯的蛋白條帶，在IPTG濃度為1mmol／L，30

6、℃誘導(dǎo)后5h時表達量最大。通過電洗脫純化VPl一VP4融合蛋白質(zhì)。’通過蛋白酶體抑制劑、溶酶體抑制劑、甘露糖受體抑制劑、清道夫受體抑制劑和巨胞飲抑制劑以不同組合處理骨髓源樹突狀細胞(BMDCs)，然后將VPlVP4融合蛋白質(zhì)負載處理后的BMDCs，與淋巴結(jié)T細胞共培養(yǎng)，以單獨的BMDCs組和T細胞組為對照，在共培養(yǎng)后9、24、48、72和96h，取其共培養(yǎng)上清液，ELISA檢測其中IFN吖和IL4含量。結(jié)果顯示，各組在各個時間點上產(chǎn)生的

7、IL4的含量均顯著低于IFN吖含量。蛋白酶體抑制劑處理組在每個時間點產(chǎn)生的IFNY含量均低于不經(jīng)抑制劑處理試驗組，但高于溶酶體抑制劑處理組，說明溶酶體在BMDCs處理提呈VPlVP4融合蛋白抗原的過程中發(fā)揮著更重要的作用。甘露糖受體抑制劑處理組在每個時間點產(chǎn)生的IFN吖含量均高于不經(jīng)抑制劑處理試驗組(除24h，P005)，說明甘露糖受體的識別作用對負載VPlVP4融合蛋白之BMDCs活化T的過程發(fā)揮抑制作用；清道夫受體抑制劑處理組在每個