a型口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白vp,1基因的克隆及其在e.coli中的表達(dá)

1、甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文A型口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP基因的克隆及其在E.coli中的表達(dá)姓名：裴仉福申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：張永光;胡永浩20040601甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 碩士學(xué)位論文摘 要口蹄疫是由口蹄疫病毒引起牛、羊、豬等偶蹄動物感染的一種急性、高度接觸性傳染病，其病毒粒子主要由4 種衣殼蛋白V P l 、V P 2 、V P 3 和V P 4 各6 0 個拷貝所組成，其中結(jié)構(gòu)蛋白v P l 內(nèi)包含口蹄疫病毒的主要抗原

2、位點，能誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生，第1 4 1 ～t 6 0和2 0 0 —2 1 3 位氨基酸殘基構(gòu)成口蹄疫病毒的主要抗原表位。同時口蹄疫病毒的V P l 基因極易發(fā)生變異，?？蓪?dǎo)致毒株抗原性及毒力的變化，也是V A 蹄疫病毒多型、多亞型的主要原因，因此v P l 在口蹄疫研究中占有重要地位。本試驗從牛舌皮組織中提取總R N A ，用設(shè)計的特異性引物，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法獲得了長度約為7 5 0 b p 左右的核酸片段，與預(yù)期長度相符。

3、擴增產(chǎn)物連接到p G E M ．T E a s y 載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌J M l 0 9 菌株，篩選氨芐青霉素抗性菌落，提取質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定、P C R 分析以及確證性測序證明，所克隆的7 5 0 b p 左右的片段含有完整的V P l基因。根據(jù)V P l 基因核苷酸序列，對A ／F C ／7 2 株與七個參考毒株進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)生樹分析，分析結(jié)果表明A ／F C ／7 2 株與x J —I ．9 9 株的遺傳關(guān)系高度相近，而與國外分離毒株

4、的遺傳關(guān)系相對較遠(yuǎn)。將重組質(zhì)粒p G E M ．F C V P l 和表達(dá)載體p G E X - 4 T - 1 同時用E c o R l 和X h o l 酶切后，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒p G E X ．F C V P l ，轉(zhuǎn)化宿主菌B L 2 1 ( D E 3 ) p L y S s ，經(jīng)酶切及P C R擴增鑒定篩選出陽性克隆。測序證明，目的基因正確插入到表達(dá)載體，用I P T G 誘導(dǎo)V P l基因的表達(dá)，收集不同時間的菌液進(jìn)行S