人卵泡抑素基因克隆及其在p.pastoris和e.coli中的表達(dá)

1、上海第二醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文人卵泡抑素基因克隆及其在P.pastoris和E.coli中的表達(dá)姓名：尤漢寧申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：內(nèi)科學(xué)（消化系疾病）指導(dǎo)教師：李定國(guó)20040401二、人F S 基因在戶p a s t o r i s 中的表達(dá)我們以P M D l 8 - T —F S 3 1 7 為模板，采用P f uD N A 聚合酶，通過P C R 的方法擴(kuò)增目的基因片段，通過X h o I 和＆D R j 限制性內(nèi)切酶將編碼F

2、S 2 8 8 的基因片段亞克隆入p P I C 9 ，構(gòu)建p P I C 9 一F S 2 8 8 ，轉(zhuǎn)化T o p l O 感受態(tài)，轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證后進(jìn)行D N A序列測(cè)定，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行B l a s t 分析后，將p P I C 9 一F S 2 8 8 采用B a m H I 和S a l i 雙酶切，回收小片段后，連接經(jīng)B a m H I 和S a l I 雙酶切的p P I C 9 K ，構(gòu)建采用f l 因子信號(hào)肽的重組分泌型表

3、達(dá)載體p P I C 9 K ．F S 2 8 8 ，通過電穿孔法轉(zhuǎn)化S M D l l 6 8 ，G 4 1 8篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子發(fā)酵后，取上清液進(jìn)行S D S ．P A G E 和W e s t e m - b l o t分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P p a s t o r i s 工程菌能分泌表達(dá)重組人F s ，分子量在5 0 ～6 0 K D之間，但其表達(dá)量不高，難以滿足蛋白純化要求。三、人F s 基因在E c o l i 中的融

4、合表達(dá)我們采用P C R 法從P M D l 8 ．T —F S 3 1 7 中擴(kuò)增編碼F S 2 8 8 的基因片段，通過B a m H I 和X h o l 亞克隆到G S T 融合表達(dá)載體p G E X ．5 X 一1 和H i s 融合表達(dá)載體p E T 一2 8 C ( 十) 中，構(gòu)建G S T 融合表達(dá)載體p G E X - 5 X 。1 ．F S 2 8 8 和H i s 融合表達(dá)載體p E T - 2 8 C - F S

5、 2 8 8 ，將p G E X 一5 X 一1 - F S 2 8 8 分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌B L 2 1 和O r i g a m i B ，經(jīng)選擇性平板篩選獲得重組轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化予發(fā)酵，菌體經(jīng)超聲破菌離心后，將上清液和沉淀分別進(jìn)行S O S —P A G E 分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，融合表達(dá)蛋白大小為5 8 K D ，以包涵體形式存在。將H i s 融合表達(dá)載體p E T - 2 8 C ．F S 2 8 8 轉(zhuǎn)化大腸桿菌B L 2 1 ，將獲

6、得的轉(zhuǎn)化子發(fā)酵表達(dá)，通過S D S ．P A G E 和W e s t e r nb l o t 分析發(fā)現(xiàn)，融合蛋白大小為3 6 K D ，主要以包涵體存在，但有少量為可溶性蛋白。對(duì)G S T —F S 2 8 8 包涵體蛋自進(jìn)行分離純化研究。將包涵體洗滌后，采用8 M 脲素溶解包涵體，通過C M —s e p h a r o s e 純化變性G S T ．F S 2 8 8 融合蛋白，采用稀釋法進(jìn)行包涵體蛋白的體外復(fù)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，變性

7、包涵體蛋白經(jīng)C M ．s e p h a r o s e 后很容易得到純化，在體外復(fù)性過程中，蛋白的收率不高，但我們?nèi)匀猾@得少量復(fù)性G S T - F S 2 8 8 融合蛋白樣品。四、重組人F S 2 8 8 及G S T —F S 2 8 8 融合蛋白的活性測(cè)定我們采用M T T 法檢測(cè)P p a s t o r i s 工程菌發(fā)酵上清液和復(fù)性G S T —F S 2 8 8 產(chǎn)品對(duì)A C TA 引起的K 5 6 2 細(xì)胞增殖的抑制