綠木霉t.virenszy01中內(nèi)切葡聚糖酶egiv基因的克隆及其在e.coli中過表達(dá)

1、A D i s s e r t a t i o nS u b m i t t e d i nP a r t i a lF u l f i l l m e n t o f t h eR e q u i r e m e n t sf o rt h eD e g r e e o f M a s t e r i nE n g i n e e r i n gC l o n i n g o f E n d o g l u c a n a s e E

2、 G I V f r o mZ v i r e n sZ Y - 0 1a n d o v e r e x p r e s s i o n i nE c o l iM a s t e r C a n d i d a t e ：M a j o r ：S u p e r v i s o r ：Q i a oH uC h e m i c a l E n g i n e e r i n g a n d T e c h n o l o g yP

3、r o f ．Z h o n g h u a Y a n gW u h a n U n i v e r s i t y o fS c i e n c ea n d T e c h n o l o g yW u h a n ，H u b e i 4 3 0 0 8 1 ，P ．R ．C h i n aM a y , 2 0 1 6摘要纖維素酶是水解纖維素及其衍生物等多糖生成單糖的一類酶的總稱，能夠解決自然界中纖維素類物質(zhì)燃燒造成的資源浪費(fèi)

4、和環(huán)境污染的問題。內(nèi)切葡聚糖酶作為纖維素酶的重要功能成分，在纖維素酶降解纖維素的過程中扮演著重要的角色?？寺?nèi)切葡聚糖酶基因并實(shí)現(xiàn)異源高效表達(dá)，有助于了解內(nèi)切葡聚糖酶的降解特性，從而提高纖維素酶降解纖維素的能力。對此，本論文從綠木霉Z v i r e n sZ Y - 0 1 中克隆得到內(nèi)切葡聚糖酶E G I V 基因，并對其進(jìn)行異源表達(dá)，進(jìn)一步對目的蛋白進(jìn)行純化，研究其酶學(xué)特性，為提高纖維素酶的酶活，實(shí)現(xiàn)高效降解纖維素及高效生產(chǎn)提供基

5、礎(chǔ)。首先，提取綠木霉z v i r e n sZ Y - 0 1 的R N A ，利用R T - P C R 的方法克隆得到內(nèi)切葡聚糖酶E G I V 的基因，將其連接至可溶性表達(dá)載體p E T - 3 2 a 上，并將其轉(zhuǎn)化至E ．c o l i D H 5 e t 。利用菌落P C R 和質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒p E T 3 2 a ．E G I V ，對鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示，目的基因E G I V 的開放閱讀框

6、為1 0 6 9b p ，編碼3 5 6 個(gè)氨基酸，與T r i c h o d e r m a v i r i d e A S3 ．3 7 1 1 菌株相比，核酸序列同源性高達(dá)9 5 ．2 ％，氨基酸的同源性高達(dá)1 0 0 ％。為了檢測目的基因的表達(dá)情況，通過熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主細(xì)胞B L 2 1 ( D E 3 ) 中，含有T 7 啟動子的重組質(zhì)粒在I P T G 的誘導(dǎo)下，能高效表達(dá)目的蛋白。對誘導(dǎo)液進(jìn)行破胞，并對破胞后

7、的粗酶液進(jìn)行親和層析鎳柱純化，S D S - P A G E分析破胞前后的上清和沉淀，測量酶液純化前后的酶活和蛋白含量，從而計(jì)算比酶活。S D S ．P A G E 結(jié)果顯示重組蛋白是胞內(nèi)酶且可溶，目的蛋白的分子量約為3 9k D a ，重組葡聚糖內(nèi)切酶E G I V 的粗酶液的比酶活為0 ．9 3 U ／m g ，親和層析純化之后，比酶活提高到6 ．0 4 U ／m g ，純化了6 ．5 倍。為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)內(nèi)切葡聚糖酶在反應(yīng)的過程中酶

8、解能力達(dá)到最大，分別測量重組酶在不同條件下降解羧甲基纖維素鈉的能力，對重組葡聚糖內(nèi)切酶的動力學(xué)參數(shù)，最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)p H ，酶的熱穩(wěn)定性、p H 穩(wěn)定性等進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，重組內(nèi)切葡聚糖酶的K m = 1 3 ．7 1 m g ／m L ，V 。。= O ．5 lg m o l ／m i n ，其最適反應(yīng)溫度和p H 分別為4 5 ℃和p H 7 ．4 ，重組內(nèi)切葡聚糖酶在2 0 - 5 0 ℃以及p H = 5 - 8的范圍