內(nèi)切型-β-葡聚糖酶基因的克隆與表達(dá).pdf

1、內(nèi)切型-β-葡聚糖酶(endo-β-glucanase，EG)是纖維素酶的重要組分之一，在纖維素水解、棉織物生物整理、飼料、造紙等領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛。本文對內(nèi)切型-β-葡聚糖酶基因的克隆及其在原核細(xì)胞、畢赤酵母和絲狀真菌中的表達(dá)進(jìn)行了系統(tǒng)研究。
　　將厭氧真菌內(nèi)切型-β-葡聚糖酶的基因celE與表達(dá)載體pET-28a(+)重組后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)。采用SDS-PAGE蛋白電泳對重組大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析，在42 kDa

2、附近得到了與目的蛋白催化區(qū)域理論值相當(dāng)?shù)牡鞍讞l帶。酶學(xué)性質(zhì)研究表明，酶蛋白的最適作用條件為pH6.0，45℃。搖瓶條件下重組大腸桿菌的EG活力可達(dá)到39.1 IU ml-1。
　　將celE基因與含有乙醇氧化酶啟動子(AOX1)的表達(dá)載體pPIC9K重組，采用基因?qū)雰x將線性化后的重組DNA導(dǎo)入畢赤酵母GS115，篩選得到3株高G418抗性的轉(zhuǎn)化子。經(jīng)PCR鑒定表明:celE基因已整合到畢赤酵母的基因組上，這一特點(diǎn)有利于保持遺傳性

3、狀的穩(wěn)定。在搖瓶培養(yǎng)條件下，以1.0％的甲醇為碳源和誘導(dǎo)物，96h發(fā)酵液中EG活力可達(dá)74.1 IU ml-1。
　　以根瘤農(nóng)桿菌AGL-1為介導(dǎo)，對里氏木霉(Trichoderma reesei) ZU-02分生孢子體系的DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行了研究。構(gòu)建了含里氏木霉纖維二糖水解酶Ⅰ強(qiáng)啟動子Pcel7a（及其信號肽）和終止子Tcel7a以及潮霉素B抗性標(biāo)記的新型重組質(zhì)粒pCB-hPsT，該質(zhì)粒適用于將目的基因?qū)肜锸夏久怪胁崿F(xiàn)分泌

4、表達(dá)，為外源基因在絲狀真菌中的克隆與高效表達(dá)提供了一個新的技術(shù)平臺。對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)孢子的預(yù)萌發(fā)處理對轉(zhuǎn)化效率的提高有重要作用，當(dāng)萌發(fā)時間從0h提升到3h，轉(zhuǎn)化效率可提高25倍以上。該研究結(jié)果對于進(jìn)一步完善絲狀真菌基因?qū)爰夹g(shù)平臺具有重要意義。
　　采用生物信息學(xué)技術(shù)分析了厭氧真菌基因和里氏木霉基因之間的序列差異，依據(jù)里氏木霉的密碼子偏好對celE序列的催化區(qū)域進(jìn)行了優(yōu)化，得到新基因序列celEn。采用pCB

5、-hPsT農(nóng)桿菌介導(dǎo)載體，分別構(gòu)建含有原始催化區(qū)域celE*和優(yōu)化催化區(qū)域celEn的重組質(zhì)粒pCB-hE*和pCB-hEn。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)將目的基因?qū)氲嚼锸夏久怪校謩e獲得了300株重組菌株T.reesei/pCB-hE*和293株重組菌株T.reesei/pCB-hEn，后者在以CMC為唯一碳源的平板上生長明顯加快，并篩選到8株高產(chǎn)CelEn的重組里氏木霉T.reesei/pCB-hEn。在搖瓶條件下發(fā)酵84h時EG活力最高可

6、達(dá)193.6 IU ml-1(pH6.0)，約是出發(fā)菌株同期EG酶活的6.0倍。該研究成功實現(xiàn)了厭氧真菌的內(nèi)切型-β-葡聚糖酶基因在好氧真菌里氏木霉中的分泌表達(dá)，所獲得的纖維素酶在牛仔織物水洗整理中具有重要的應(yīng)用價值，該項研究成果填補(bǔ)了國內(nèi)中性纖維素酶的生產(chǎn)空白。
　　采用pCB-hPsT農(nóng)桿菌介導(dǎo)載體，將里氏木霉的內(nèi)切型-β-葡聚糖酶基因cel5a置于強(qiáng)啟動子Pcel7a和終止子Tcel7a之間，進(jìn)一步導(dǎo)入并整合到T.reese