綠色木霉內切葡聚糖酶高產(chǎn)菌株的誘變及組分Ⅱ基因的克隆表達.pdf

1、本研究以實驗室保藏的一株酸性纖維素內切葡聚糖酶(endo-1，4-β-D—glucanase，EG)產(chǎn)生菌綠色木霉(Trichodermaviride)WL0512(酶活性2411.1U/g干曲)作為原始出發(fā)菌株，通過自然分離篩選出一株產(chǎn)酶較穩(wěn)定的TVN-13(酶活性2565.0U/g干曲)作為誘變出發(fā)菌株，將TWN-13菌株用真空微波和甲基磺酸乙酯(EthylMethane—sulfonate，EMS)逐級誘變處理，獲得了一株高產(chǎn)、穩(wěn)

2、產(chǎn)內切葡聚糖酶的突變株E6—6。該菌株產(chǎn)內切葡聚糖酶活性達4659.1U/g干曲，是原始出發(fā)菌株WL0512酶活性的1.93倍。通過對固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的初步優(yōu)化，使突變株的產(chǎn)酶能力提高了14.1％，達到5316.3U/g干曲。對E6—6所產(chǎn)內切葡聚糖酶進行最適反應pH和pH穩(wěn)定性實驗，結果顯示其為酸性酶。 根據(jù)GenBank報道的來源于木霉屬的內切葡聚糖酶II基因序列的保守區(qū)域設計引物，采用RT—PCR方法擴增得到綠色木霉突變株E

3、6—6和出發(fā)菌株TVN-13的內切葡聚糖酶成熟肽基因egII和egII’的cDNA序列，分別構建重組質粒pTG19—T—egII和pTG19—T—egII’，測序發(fā)現(xiàn)兩序列同源性為100％。egII全長1194bp，編碼397個氨基酸，理論分子量為42.2kDa。利用Blast軟件進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)egII的氨基酸序列同編碼木霉屬內切葡聚糖酶的氨基酸序列同源性最高達到94％，將該基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(登錄號EF602036

4、)。 將內切葡聚糖酶egII基因序列插入大腸桿菌(Escherichiacoli)表達載體pET-28aq(+)的NcoI和HindIII酶切位點之間，得到重組質粒pET-28a(+)—egII，將該質粒分別轉入大腸桿菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中進行IPTG誘導表達。SDS-PAGE分析顯示，重組菌BL21(DE3)/egII胞內胞外均未無明顯特異性蛋白條帶；Rosettaq(DE3)/egII胞內出現(xiàn)分子量

5、約為42kDa特異性蛋白條帶，且隨著誘導時間的延長蛋白表達量增大，但很難檢測到內切葡聚糖酶活性。 將內切葡聚糖酶egII基因序列插入畢赤酵母(Pichiapastoris)穿梭質粒pPIC9K的EcoRI和NotI酶切位點之間，得到重組質粒pPIC9K—egII。將該質粒經(jīng)NcoI線性化后電擊轉化入畢赤酵母GS115中。經(jīng)甲醇誘導，內切葡聚糖酶在重組畢赤酵母中實現(xiàn)了分泌表達，搖床水平上培養(yǎng)96h酶活性達到15.48U/mL；胞內