瑞氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶Ⅰ及其CBD的噬菌體表面展示.pdf

1、瑞氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶Ⅰ(EndoglucanaseⅠ，EGI)在降解纖維素的過程中是一種十分重要的酶。該酶作用于纖維素內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解β-1，4-糖苷鍵。EGI包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是纖維素的催化結(jié)構(gòu)域(catalyticdomains，CD)，一個(gè)是纖維素的吸附結(jié)構(gòu)域(cellulose-bindingdomains，CBD)，二者由一個(gè)連接區(qū)(Linker)連接。 本文意圖在不改變EGI的CD和Linker的前提下，對(duì)

2、CBD進(jìn)行隨機(jī)突變，通過篩選找到與野生型相比纖維素吸附能力改變的CBD，再將其與CD和Linker結(jié)合構(gòu)建雜合酶，比較研究雜合酶的性質(zhì)，進(jìn)一步闡明CBD與CD和Linker相互作用降解纖維素的機(jī)理。 噬菌體表面展示技術(shù)(Phagedisplay)是一種新型的篩選方法，它使表達(dá)的外源肽(或者蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域)以融合蛋白的形式展現(xiàn)在噬菌體的表面，并保持相對(duì)獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性。與傳統(tǒng)篩選手段相比，該技術(shù)更加高效，尤其是在親和篩選方

3、面可以很方便地得到與配體結(jié)合能力不同的受體，而且篩選庫的容量很大，是一種很適合本研究的篩選方法。近年來，噬菌體表面展示技術(shù)亦開始被應(yīng)用于酶學(xué)定向進(jìn)化的研究。目前，國內(nèi)外未見有纖維素酶噬菌體展示的報(bào)道。如果可以將EGI成功地展示在噬菌體表面，無疑將會(huì)對(duì)應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行纖維素酶研究提供有力的幫助，這也是本文的一個(gè)工作內(nèi)容。 本文首先將EGI展示在絲狀噬菌體表面，分別用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linkedimmunosorben

4、tassay，簡稱ELISA)和Somogyi方法對(duì)其活性進(jìn)行驗(yàn)證。被展示在噬菌體表面的EGI依然具有纖維素的吸附能力和內(nèi)切酶活力，其CMC(carboxymethylcellulose)酶活為7.0×10-16IU/pfu，說明EGI被成功展示在絲狀噬菌體表面。 然后再將EGI的CBD展示在噬菌體表面，通過ELISA方法驗(yàn)證被展示的CBD依然具有對(duì)纖維素的吸附特性。利用易錯(cuò)PCR的方法對(duì)CBD基因進(jìn)行隨機(jī)突變，建立了一個(gè)5×1

5、05大小的、可用來進(jìn)行噬菌體表面篩選的CBD基因突變菌種庫。為進(jìn)一步合理解釋吸附后CBD是如何與CD和Linker相互作用降解纖維素的問題提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 此外，利用含EGI和CBD基因的兩種重組噬菌體感染大腸桿菌宿主HB2151，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)游離型EGI和CBD。經(jīng)過胞內(nèi)、胞外、胞周質(zhì)各組分蛋白SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)游離型EGI和CBD主要分泌在大腸桿菌HB2151的胞外。進(jìn)一步對(duì)CBD進(jìn)行了初步純化。純化后的