高效耐酸耐熱木聚糖酶及木聚糖酶-甘露聚糖酶雙功酶的構(gòu)建.pdf

1、木聚糖酶和甘露聚糖酶作為半纖維素酶類，被廣泛的應(yīng)用于食品、飼料、造紙、紡織和醫(yī)藥等領(lǐng)域。
　　 本研究對(duì)來源于Aspergillus niger的兩種木聚糖酶基因進(jìn)行基因序列優(yōu)化、拼接合成及表達(dá)，研究了重組木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)，優(yōu)化了重組木聚糖酶基因工程菌的培養(yǎng)條件，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建木聚糖酶-甘露聚糖酶/甘露聚糖酶-木聚糖酶雙功酶，考察了雙功酶的酶學(xué)性質(zhì)以及連接肽對(duì)酶學(xué)性質(zhì)的影響。主要內(nèi)容包括以下方面:
　　 1.重組木聚

2、糖酶的構(gòu)建及發(fā)酵條件的優(yōu)化
　　 本研究對(duì)兩條木聚糖酶進(jìn)行了密碼子序列和mRNA穩(wěn)定性的優(yōu)化，將優(yōu)化后的基因分割成相互重疊的短寡核苷酸片段，通過DA-PCR和OE-PCR拼接出全長的基因并在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。
　　 純化后的重組Xyn10和Xyn11的SDS-PAGE電泳顯示的條帶分別位于33 kDa和20 kDa，與理論大小一致，且比酶活大小分別為2504U/mg和22253 U/mg。重組Xyn10最適溫度和pH

3、分別為60℃和5.0，經(jīng)80-90℃和pH2.2處理后酶活幾乎完全喪失。重組Xyn11最適溫度和pH為50℃和5.0，該重組酶在pH1.0-12.0下處理2h仍然具有71％以上的酶活力，在90℃處理10 min仍有40％的酶活。兩種重組酶都對(duì)樺木木聚糖的親和力最大，而對(duì)山毛櫸木聚糖的催化效率最高，其中重組Xyn11對(duì)山毛櫸木聚糖的催化效率達(dá)到3401.08 mL/mg/s。
　　 本研究從400株Xyn11重組子中篩選獲得一株高

4、表達(dá)且遺傳穩(wěn)定的重組菌株Ax11-151，通過單因子和響應(yīng)面優(yōu)化后，搖瓶發(fā)酵48 h的重組Xyn11產(chǎn)量達(dá)到2883.86 U/mL，是優(yōu)化前的2.51倍。
　　 2.木聚糖酶-甘露聚糖酶和甘露聚糖酶-木聚糖酶融合酶的構(gòu)建
　　 選取性質(zhì)較好的木聚糖酶基因xyn11和甘露聚糖酶基因man26作為親本，采用木聚糖酶-甘露聚糖酶和甘露聚糖酶-木聚糖酶兩種連接順序以及(GGGGS)n和(EAAAK)n（2≤n≤4）作為連接肽，

5、通過酶連法和重疊延伸拼接法構(gòu)建了15種正確連接的融合酶基因以及3種突變基因，15種融合基因在畢赤酵母中都得以成功表達(dá)并表現(xiàn)出雙功能酶活性。重組融合酶存在高度糖基化現(xiàn)象，經(jīng)去糖基化酶EndoH處理后重組融合酶呈現(xiàn)的條帶與理論值57-58 kDa一致。
　　 15種融合酶的作用溫度和作用pH性質(zhì)與親本差異不大。但連接肽為(EAAAK)n(2≤n≤4)的雙功酶的熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性均高于連接肽為(GGGGS)n(2≤n≤4)的雙功酶。雙

6、功酶對(duì)底物燕麥木聚糖的親和力和催化效率（kcat口/Km）僅為親本Xyn11的21％-42％，而融合酶對(duì)底物刺槐豆角催化效率則高于親本Man26。連接肽為3個(gè)重復(fù)的(GGGGS)/(EAAAK)的雙功酶對(duì)兩種底物的催化效率高于2個(gè)和4個(gè)重復(fù)的(GGGGS)/(EAAAK)的雙功酶。
　　 N端為木聚糖酶序列的融合雙功酶XE3M和XS3M降解絲瓜絡(luò)的協(xié)同效率明顯高于N端為甘露聚糖酶的融合雙功酶ME3X和MS3X;融合雙功酶對(duì)70-