耐熱木聚糖酶雜合基因的構(gòu)建、表達(dá)及產(chǎn)物的酶學(xué)特性研究.pdf

1、飼料在制粒時(shí)溫度70~80℃,易造成木聚糖酶大量失活,所以提高熱穩(wěn)定性直接關(guān)系到其在飼料工業(yè)中的應(yīng)用前景,是當(dāng)前急待解決的重大難題.該研究篩選出能產(chǎn)木聚糖酶的微生物;克隆并在大腸桿菌中表達(dá)了木聚糖酶基因或cDNA,對產(chǎn)物特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究;在此基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)、構(gòu)建并表達(dá)了耐熱木聚糖酶雜合基因HX,系統(tǒng)地評價(jià)了表達(dá)產(chǎn)物活性和耐熱性能.主要研究結(jié)果如下:采用RBB-木聚糖水解透明圈技術(shù),篩選出具有木聚糖酶活性的不同微生物.單位發(fā)酵液中木聚糖酶

2、活性由高到低依次為黑曲霉FS6(木聚糖酶ANXW)、枯草芽孢桿菌2(酶BSXW)、環(huán)狀芽孢桿菌BC(酶BCXW)和褐色高溫單孢菌TF(酶TfxW);對其主要生化特性研究表明,酶TfxW、BSXW、BCXW和ANXW最適反應(yīng)pH分別為6.0、6.0、5.0和5.0,最適反應(yīng)溫度分別為70℃、60℃、50~60℃和50℃;酶BSXW、BCXW和ANXW在低溫下活性較高,而TfxW在高溫下酶活相對較高.采用基因克隆技術(shù),分別克隆了枯草芽孢桿菌

3、2、環(huán)狀芽孢桿菌BC和褐色高溫單孢菌TF木聚糖酶基因以及黑曲霉FS6木聚糖酶cDNA.采用亞克隆技術(shù),以pET-30(a)+為表達(dá)載體,在E.coliBL21中表達(dá)了枯草芽孢桿菌2和褐色高溫單孢菌TF木聚糖酶基因以及黑曲霉FS6木聚糖酶cDNA,分別獲得了陽性重組表達(dá)子E.coli BSX、E.coli Tfx和E.coli ANXE,其中E.coli ANXE表達(dá)產(chǎn)物為包涵體,經(jīng)復(fù)性具有木聚糖酶活性.分離和純化了基因工程菌E.coli