16595.β甘露聚糖酶基因的克隆、表達及酶學性質研究

1、THECLONINGANDEXPRESSIONOFflMANNANASEGENEANDITSRECOMBINEDENZYMATICPROPERTIESADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanNonTlalUniversitvinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByFluWenboSupe

2、rvisor：ProfZhangJianxinMay，2012摘要類芽孢桿菌cH3(Paenibacilh“spCH一3)是本實驗室從刺槐種子中篩選分離到的一株植物內生菌，具有較強的蟑甘露聚糖酶活性，采用簡并PCR和1AILPCR(thermalasymmetricinterlacedPCR)技術從該菌基因組DNA中克隆得蓼臟甘露聚糖酶基因(marA)。序列分析表明，該基因開放閱讀框(ORF)為984bp，編碼一個含有327個氨基酸、等

3、電點為701、理論分子量約為35270KDa的蛋白，N端前32個氨基酸為其信號肽。同源性分析顯示t該酶氨基酸序列與來源于PaenibacillusspA1MANAI的氨基酸序列同源性高達8135％，屬于糖苷水解酶5家族(GH5)的一員。通過對該酶分子三維結構的預測分析，該酶的二級結構由14個a螺旋和15個口折疊股構成，其催化域采用一定的折疊方式形成TIM桶狀結構。根據(jù)表達載體pET32a()或pET28a()的多克隆位點及目的基因序列特

4、點。選擇BamH，和Sal，酶切位點處作為目的基因的插入位置。構建重組表達質粒pETmanA，并將其轉入大腸桿菌表達系統(tǒng)BL21(DE3)，經過誘導獲得了此酶的高效表達。對重組聲一甘露聚糖酶酶活力進行初步檢測，結果顯示，酶活力可達9034U／ml。表達產物經SDS—PAGE凝膠電泳分析，蛋白圖譜顯示1條大約為504KDa(pET28a表達系為394KDa)的特異性條帶。實驗探討了溫度、誘導物(IPTG)濃度和誘導時間三種單因素對重組肛甘

5、露聚糖酶基因工程菌產酶的影響，并在此基礎上設計了正交組合試驗，結果顯示，該菌搖瓶發(fā)酵的最佳條件組合為：發(fā)酵溫度28℃，IPTG005mM，誘導時間12h，且在此發(fā)酵條件下，酶活力可達105417U／mL，比初始酶活提高了約107倍。各因素對該菌產酶的影響大小依次為誘導物(IPTG)濃度誘導時間瓦作項(溫度IPTG濃度))溫度。50L發(fā)酵罐中進行該茁擴大培養(yǎng)試驗，結果表明，在添加誘導物(廿TG)2h后肛甘露聚糖酶的活力就已達到較高水平，誘