來源于Caldibacillus cellulovorans的耐熱甘露聚糖酶的全基因合成,表達及酶學性質分析.pdf

1、甘露聚糖酶(mannanase)來源廣泛，大量存在于植物，動物和微生物。其中微生物存在種類繁多、性質優(yōu)良的甘露聚糖酶，且易于培養(yǎng)，是理想的β-甘露聚糖酶來源。已有大量來源于細菌的甘露聚糖酶被研究，其中耐熱甘露聚糖酶的研究仍受到科學家們的關注。在食品、飼料等眾多行業(yè)中，需要大量高溫環(huán)境下使用的生物活性添加劑，其相關高反應溫度，耐熱性好的酶類仍然缺乏研究。國內(nèi)外已有研究出的耐熱甘露聚糖酶，目前還沒有能夠得到很好推廣利用，應用很有限，其原因是

2、市場供給不足，酶學性質難以工業(yè)化使用，并且價格高。挖掘出耐熱效率高并利用高效表達系統(tǒng)使該甘露聚糖酶進行外源高效率表達，從而低成本、規(guī)?；卮罅可a(chǎn)甘露聚糖酶酶供更多人所用，無疑是解決這一問題的有效方法之一。
　　本研究應用基因工程，蛋白工程和發(fā)酵工程技術獲得具有自主知識產(chǎn)權的甘露聚糖酶高產(chǎn)工程菌，為甘露聚糖酶在食品與飼料方向的工業(yè)化應用提供理論依據(jù)和條件，本研究主要工作包括以下內(nèi)容：在不改變耐熱甘露聚糖酶ManAd3原始氨基酸序列

3、的基礎上，根據(jù)已知耐熱甘露聚糖酶ManAd3氨基酸序列，為了提高甘露聚糖酶在巴斯德畢赤酵母中的表達量，參照巴斯德畢赤酵母密碼子使用情況，優(yōu)先選擇畢赤酵母最偏愛的密碼子，部分使用次偏好密碼子，從而盡量消除mRNA穩(wěn)定的二級結構，設計并全基因合成了甘露聚糖酶基因ManAHr(Accession No.KJ806637)。將人工合成的甘露聚糖酶基因 ManAHr利用基因工程技術與pPIC9k質粒進行連接，構建分泌型重組酵母表達載體pPIC9k

4、-ManAHr，并將其轉化畢赤酵母GS115得到重組子，該重組菌株發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE鑒定，其中甘露聚糖酶ManAHr含量達到電泳純級別，分子量大小約為30 kDa。通過發(fā)酵罐發(fā)酵條件的優(yōu)化，尋找重組蛋白的表達的最佳發(fā)酵條件，通過甲醇與甘油不同比例的混合補料，有效的避免了甲醇中毒情況，進一步提高了甘露聚糖酶的產(chǎn)量。
　　實驗結果表明，重組甘露聚糖酶酶學性質檢測結果顯示該酶最適反應溫度為75℃，最適反應pH為6.0，比活力高達