1株產(chǎn)堿性木聚糖酶菌株的篩選、產(chǎn)酶條件與酶學(xué)性質(zhì)研究及其木聚糖酶基因的克隆表達(dá).pdf

1、半纖維素是僅次于纖維素含量第二豐富的可利用自然資源，其主要成分是木聚糖(xylan)。木聚糖的來(lái)源不同，分枝程度不同，其主鏈和支鏈帶有多種不同的取代基團(tuán)。由于木聚糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，它的完全降解需要多種水解酶的參與共同作用完成。β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶(EC.3.2.1.8)能夠以內(nèi)切方式作用木木聚糖主鏈產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的木寡糖和少量的木糖，因此它是木聚糖降解酶中最關(guān)鍵的酶。 本試驗(yàn)采用剛果紅染色的方法篩選出一株耐堿性木聚糖酶高產(chǎn)菌株，

2、對(duì)其產(chǎn)酶條件及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，并通過(guò)基因克隆手段得到編碼木聚糖酶的基因，實(shí)現(xiàn)該基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)，整個(gè)試驗(yàn)分三部分進(jìn)行。 1.根據(jù)水聚糖酶分解木聚糖底物生成的寡糖不能被剛果紅染色，從而在菌落周圍形成透明圈這一特性，對(duì)從武漢晨鳴紙廠采集的堿性紙漿進(jìn)行生孢子處理，根據(jù)不同菌株所形成的透明圈的有無(wú)，決定需要復(fù)篩的菌株，經(jīng)產(chǎn)酶基本培養(yǎng)基復(fù)篩后，篩選到一株堿性木聚糖酶高產(chǎn)菌株，對(duì)該菌株進(jìn)行普通染色、革蘭氏染色、形態(tài)學(xué)特征和16S

3、rDNA序列分析，初步確定該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus.Subtilis)，并且命名為BYG6-6。 2.對(duì)其生長(zhǎng)條件和產(chǎn)酶條件研究結(jié)果表明，該菌適宜在pH7.0、溫度33℃下生長(zhǎng)。為了給菌體提供有效的營(yíng)養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)基中的氮源和碳源進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，應(yīng)用樺木木聚糖作為碳源、牛肉膏作為氮源的培養(yǎng)基，能夠使細(xì)菌很好的生長(zhǎng)，并表現(xiàn)良好的產(chǎn)酶能力。 改變木聚糖酶和底物作用時(shí)的溫度和pH值，確定該酶的最適值及其耐受性。

4、結(jié)果顯示：該酶最適反應(yīng)溫度為酶反應(yīng)的最適溫度為55℃。在65℃時(shí)酶活仍有73.07％.證明該酶屬于嗜中溫酶類，不具有高溫耐受性；酶反應(yīng)最適pH值為6.74，在pH為7.22時(shí)剩余木聚糖酶的活力為91.8％，即使反應(yīng)pH值升高到9.0和10.0時(shí)，剩余酶活力仍在70％以上，說(shuō)明該菌株所產(chǎn)酶具有較強(qiáng)的耐堿性。 3.根據(jù)已經(jīng)報(bào)到的枯草芽胞桿菌木聚糖酶基因，設(shè)計(jì)特異性引物從BYG6-6基因組中擴(kuò)增得到一個(gè)基因片段，連接到pGEM-T V

5、ector載體上測(cè)序得到該基因序列，經(jīng)在線比對(duì)分析該基因與已報(bào)道的木聚糖酶基因的同源性達(dá)到99％以上。借助軟件分析表明：該基因全長(zhǎng)642個(gè)堿基，基因序列為一個(gè)完整的閱瀆框，起始密碼為ATG，終止密碼TAG連續(xù)編碼214個(gè)氨基酸，分子大小約為24kDa。 我們利用引物B3-up和B3-down，從高產(chǎn)術(shù)聚糖酶的枯草芽孢桿菌BYG6-6中克隆木聚糖酶基因，接著將其構(gòu)建在表達(dá)載體PET-28(a)中，用 Escherichia col