產(chǎn)木聚糖酶菌株的誘變及酶學(xué)特性的研究.pdf

1、木聚糖酶是一類可降解木聚糖的酶系。木聚糖(Xylan)是一類分子結(jié)構(gòu)變化范圍很大的多糖，其主鏈由D-木糖以β-1，4-糖苷鍵連接而成，側(cè)鏈?zhǔn)怯稍S多短的取代基，如L一阿拉伯糖殘基、4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸殘基、O-乙?；冉M成。木聚糖是自然界中僅次于纖維素的一類多糖，分布廣泛，是一種重要的可再生資源。木聚糖酶是人類利用木聚糖的重要工具，它在造紙、食品、飼料、生物質(zhì)轉(zhuǎn)化以及果汁、酒類、咖啡、香料和色素生產(chǎn)等方面有著廣泛的應(yīng)用前景，已經(jīng)引

2、起越來越多研究者的重視。米曲霉(Aspergillus oryzae)在傳統(tǒng)發(fā)酵食品中應(yīng)用歷史悠久，已被用于工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)之中，且是美國(guó)FDA認(rèn)可的安全微生物菌種。 本論文通過初步篩選，確定米曲霉(Aspergillus oryzae Cohn，As 3.4382)為最適合誘變菌種，并對(duì)其進(jìn)行誘變，獲得一株產(chǎn)木聚糖酶量較高且遺傳穩(wěn)定的突變菌株。對(duì)該突變菌株的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，利用雙水相法研究了木聚糖酶提取純化工藝，通過分析比較

3、酶的產(chǎn)生和細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)系，確定了該菌株產(chǎn)酶的模式為同步合成型，并由此建立了該突變菌株的生長(zhǎng)模型。試驗(yàn)結(jié)果如下： 1．米曲霉的誘變。論文采用紫外誘變和亞硝酸誘變結(jié)合的方法對(duì)米曲霉進(jìn)行菌種誘變。用剛果紅平板染色法篩選突變菌株，根據(jù)死亡率確定最佳誘變條件為：菌懸液濃度為1.0×10<'6>個(gè)，亞硝酸誘變60s，紫外照射10s。經(jīng)誘變處理后，獲得3株酶活較高的誘變菌株，其中兩株遺傳性能穩(wěn)定。本文選取酶活較高的一株作為后續(xù)研究的對(duì)象。

4、 2．突變菌株產(chǎn)酶條件的優(yōu)化。本文采用單因素(one time one factor)實(shí)驗(yàn)確定產(chǎn)酶最優(yōu)條件為：種齡72h，接種量5％，裝液量50ml/250ml，轉(zhuǎn)速150r/min，溫度28℃，初始pH值為5.0，發(fā)酵周期3天。通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法(Response surfacemethodology，RSM)獲得突變菌株的最佳培養(yǎng)基配方：麩皮，2％；酵母膏，1％；吐溫80，0.25ml；磷酸氫二鉀，

5、2.6％；氯化鈣，0.5％；硫酸鎂，1％；硫酸亞鐵，0.016％；硫酸鋅，0.006％。 3．利用雙水相法提取木聚糖酶。本文利用雙水相法對(duì)木聚糖酶粗酶進(jìn)行提純，確定最佳純化條件為：PEG 8000、PEG 8000濃度為19％(w/w)、磷酸氫二鉀濃度為13％(w/w)、氯化鈉濃度為0(w/w)，木聚糖酶提取量達(dá)到97.58％。 4．木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)的研究。木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，最適pH值為5.0，在4.0-6

6、.5之間，酶活可保持在最高酶活的80％左右，此酶在酸性條件下較穩(wěn)定。Co<'2+>和Fe<'2+>對(duì)酶有強(qiáng)烈的激活作用，而Fe<'3+>和Ba<'2+>酶活有一定的激活作用。除了Ca<'2+>和Zn<'2+>離子有較強(qiáng)烈的抑制作用外，Pb<'2+>、Mg<'2+>、Cu<'2+>、Mn<'2+>、Li<'2+>各離子也均有不同程度的抑制作用，但抑制程度都不大，其殘余酶活性均在50％以上。測(cè)得該酶在各個(gè)溫度下的半衰期分別為：50℃時(shí)為10

7、5min，55℃時(shí)為45min，60℃時(shí)為15min，4℃時(shí)約為33d。 5．米曲霉生長(zhǎng)模型的建立。本文通過比較米曲霉突變菌株的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線，確定此突變米曲霉菌株產(chǎn)酶是屬于同步合成型，并對(duì)米曲霉的生長(zhǎng)模型進(jìn)行了探討，得到數(shù)學(xué)模型式為N=139.3388/(1+28.7922e<'-0.0593t>)。此模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有著較好的擬合性。菌體極限值為1.39×10<'6>個(gè)/ml，最大比生長(zhǎng)速率為0.0593h<'-1>，拐點(diǎn)