酵母木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、木聚糖酶可以降解麥類飼料中的木聚糖，降低消化道食糜的黏性，破壞植物細(xì)胞壁，釋放細(xì)胞內(nèi)的養(yǎng)分，促進(jìn)動物對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的利用。畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)系統(tǒng)是目前分子生物學(xué)領(lǐng)域中用于表達(dá)重組蛋白的標(biāo)準(zhǔn)工具之一。為確定木聚糖酶基因在畢赤酵母中表達(dá)后所分泌木聚糖酶的特性，本試驗從體外和體內(nèi)兩個方面對該木聚糖酶的一些基本性質(zhì)進(jìn)行了研究。 首先在實驗室采用還原糖法(即DNS法)對該木聚糖酶的一些基本性質(zhì)(包括最適pH和p

2、H穩(wěn)定性、最適溫度和溫度穩(wěn)定性、酶反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)、酶的底物特異性及蛋白酶對酶活性的影響)進(jìn)行研究。在不同pH的緩沖液中測定該酶的活性，結(jié)果表明該酶的最適pH為6.1，在37、40、50℃保溫30、60min后，酶在pH5-10之間具有較好的穩(wěn)定性，不同保溫時間對酶活影響差異不顯著。在不同溫度下測定該木聚糖酶的酶活，發(fā)現(xiàn)其最適反應(yīng)溫度為51℃，當(dāng)將酶液在50、60、70、80、90、100℃分別保溫30min后，發(fā)現(xiàn)其穩(wěn)定性隨溫度升高而降

3、低，60℃以下時穩(wěn)定性較好。配制不同濃度的燕麥木聚糖底物，在51℃、pH6.1下，測得該木聚糖酶的米氏常數(shù)Km=6.49mg·mL-1，最大反應(yīng)速度Vmax=21.05μg·mL-1·min-1。分別以燕麥木聚糖和樺木木聚糖為底物測定酶活，結(jié)果以樺木木聚糖為底物時的酶活僅為燕麥木聚糖為底物時的74.21％。37℃下用胃蛋白酶和胰蛋白酶處理木聚糖酶不同的時間(30、60、120min)后，發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶處理組酶活損失較大，在60min時只剩

4、1.08％的活性，而胰蛋白酶組在處理120min后仍然可保持80.95％的活性。 在確定了該木聚糖酶基本酶學(xué)性質(zhì)的基礎(chǔ)上，又選取10頭21kg左右的健康DLY生長豬，按體重隨機(jī)分成2組，分別飼喂添加了0.1％和1.0％木聚糖酶的飼料。正式試驗前先預(yù)飼4天，第五天開始，每隔15min飼喂一頭豬，于采食2h后將豬屠宰，收集胃、十二指腸和空腸食糜，測定其中木聚糖酶的活性，結(jié)果表明：在同一添加水平中，隨著食糜的后移，消化道后段食糜中的酶

5、活都顯著高于前段，在0.1％組，胃、十二指腸、空腸每克食糜中的酶活分別是1172.84IU、2623.22IU、3627.97IU；而在1.0％組，各段消化道每克食糜中的酶活分別是2270.38IU、2656.81IU、4434.33IU；兩個酶水平組差異不顯著。 綜上所述，在本試驗研究條件下，該木聚糖酶的最適反應(yīng)pH為6.1，在pH5-10之間穩(wěn)定性較好；最適反應(yīng)溫度為51℃，液體狀態(tài)時60℃以下穩(wěn)定性較好。該木聚糖酶在胃中活