木聚糖誘導條件下黑曲霉特異基因表達分析及高表達堿性木聚糖酶產(chǎn)黃青霉菌株構(gòu)建研究.pdf

1、植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素及木質(zhì)素等物質(zhì)組成。木聚糖是植物半纖維素的重要組分，是自然界中除纖維素外最為豐富的多糖，也是自然界中主要的可再生資源。隨著人口增長和資源消耗，對于可再生資源的開發(fā)與利用成為學術(shù)界共同關(guān)注的問題。
　　 絲狀真菌黑曲霉作為具有重大經(jīng)濟價值的植物物質(zhì)水解酶工業(yè)生產(chǎn)菌株已有多年歷史，其全基因組測序已經(jīng)完成。黑曲霉生產(chǎn)的半纖維素酶和降解復雜多糖的其它水解酶類已被廣泛應(yīng)用于食品、紡織和制漿造紙工業(yè)等行業(yè)。黑

2、曲霉能夠產(chǎn)生高活力的木聚糖酶。絲狀真菌木聚糖酶基因已經(jīng)大量克隆并進行了表達，研究的水平已深入到分子水平，而且對基因表達調(diào)控也進行了一定的研究，但是研究主要針對單基因或幾個基因，從基因組水平和蛋白組水平上進行全面地、系統(tǒng)性地研究的很少，無法反映出絲狀真菌木聚糖分解代謝的全貌，而且至今對木聚糖酶的分子誘導機制了解還比較少。因此，從基因組水平上研究絲狀真菌半纖維素分解在基礎(chǔ)理論與應(yīng)用開發(fā)研究中都顯得很有必要。其中一些重要新基因功能的闡明有助于

3、明晰黑曲霉木聚糖酶的誘導機理、代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控或重要的信號轉(zhuǎn)導機制，對優(yōu)化黑曲霉的發(fā)酵、產(chǎn)酶過程及菌株的定向遺傳改造將具有積極的推動作用。本文以黑曲霉為研究對象，采用抑制性消減雜交技術(shù)對在木聚糖誘導下及未誘導下進行基因差異表達的研究。
　　 目前對絲狀真菌的宿主表達系統(tǒng)主要集中在Trichoderma reesei和A.niger，關(guān)于產(chǎn)黃青霉的研究較少，主要是對其抗生素的合成調(diào)控進行了細致深入的研究。產(chǎn)黃青霉是許多酶制劑和抗生素等

4、的工業(yè)生產(chǎn)菌，能分泌合成蛋白酶、木聚糖酶和葡萄糖氧化酶。它具有極好的合成蛋白和分泌蛋白的能力，當在含有1％木聚糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，發(fā)酵液中木聚糖酶的含量高達40％，這表明產(chǎn)黃青霉的木聚糖酶啟動子屬于強啟動子，能夠向胞外分泌大量的蛋白，因此產(chǎn)黃青霉是優(yōu)良的真核生物基因表達系統(tǒng)，是一種潛在的“細胞工廠”。另一方面，產(chǎn)黃青霉纖維素酶活性極低。這些特點對于表達用于改善紙漿質(zhì)量和生物漂白的堿性木聚糖酶基因是非常有利的，本文究選用產(chǎn)黃青霉作為表達的

5、宿主系統(tǒng)高效對來自嗜堿桿菌的木聚糖酶基因進行表達。
　　 本文的主要研究內(nèi)容如下：
　　 1.高產(chǎn)木聚糖酶黑曲霉菌株的誘變及培養(yǎng)條件的優(yōu)化
　　 采用UV和硫酸二乙酯(DES)對黑曲霉進行誘變，篩選到一株酶活達6235U/ml的突變菌株，編號為An-19。對其菌落形態(tài)進行了掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)與出發(fā)菌株相比，突變株的分生孢子呈現(xiàn)棕黃色，體積偏大，菌絲直徑增粗。生長速度快，3 d就能覆蓋整個平板。對突變株和出發(fā)株的木

6、聚糖酶基因進行了克隆，測序發(fā)現(xiàn)兩者基因的相似度為100％，說明誘變沒有改變木聚糖酶基因的一級結(jié)構(gòu)。對突變株的遺傳穩(wěn)定性進行了研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)10代后突變株的木聚糖酶活性保持不變，說明突變株是一株產(chǎn)木聚糖酶穩(wěn)定的菌株。采用中心組合試驗和Design-Expert7.0軟件對突變株的培養(yǎng)條件進行響應(yīng)面優(yōu)化，結(jié)果得到最佳培養(yǎng)基為麩皮20g/L，NH4NO310g/L和碳酸鈣20g/L，優(yōu)化條件下酶活高達8516U/mL，比出發(fā)菌株提高56.31％

7、。
　　 2.黑曲霉抑制性消減雜交文庫的構(gòu)建及差異序列的分析
　　 為了分離和鑒定黑曲霉木聚糖代謝相關(guān)基因，以經(jīng)過1.0％木聚糖誘導的菌絲體為實驗組，未誘導的為驅(qū)動組，用抑制消減雜交法(SSH)構(gòu)建了黑曲霉木聚糖誘導正向消減文庫。菌落PCR顯示插入片段在250～1000 bp之間，逆向斑點雜交驗證黑曲霉消減文庫質(zhì)量良好。從黑曲霉木聚糖誘導的消減文庫中，隨機選取了119個不同插入片段的陽性克隆進行測序。測序結(jié)果經(jīng)BLAST

8、x分析，表明這些序列大部分與絲狀真菌木聚糖代謝的相關(guān)酶基因具有較高的相似性?？偣埠Y選出41個有效的差異表達基因cDNA片段，其中有7個cDNA片段編碼轉(zhuǎn)運蛋白，占測序克隆的5.9％，包括糖轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因4個，分別為木二糖轉(zhuǎn)運蛋白、木糖轉(zhuǎn)運蛋白、阿拉伯糖轉(zhuǎn)運蛋白和己糖轉(zhuǎn)運蛋白基因。共有22個cDNA片段編碼水解酶，占測序克隆的18.4％；其中，編碼糖苷水解酶的基因有12個包括內(nèi)切木聚糖酶A和B、β-木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、α-半乳糖苷酶

9、、β-葡萄糖苷酶、D-木酮糖激酶，以及木糖醇脫氫酶、醛糖差向異構(gòu)酶、內(nèi)切葡聚糖酶A、α-葡萄糖醛酸酶和阿魏酸酯酶基因。搜索黑曲霉的基因組序列，獲得特異表達序列的全長序列。對完整基因序列分析發(fā)現(xiàn)，特異表達的糖苷水解酶基因除了阿拉伯糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因外，其余基因的啟動子區(qū)域中均含有特異序列5'-GGCTAA，而該序列可以和XlnR發(fā)生特異性結(jié)合，從而增強木聚糖酶系基因的表達。此外，發(fā)現(xiàn)纖維素酶系中的內(nèi)切葡聚糖酶Ⅲ和β-葡萄糖苷酶基因

10、啟動子區(qū)也含有5'-GGCTAA序列，表明受到XlnR的調(diào)控，這說明XlnR除了作為木聚糖酶轉(zhuǎn)錄激活因子外，還參與調(diào)控纖維素降解酶部分基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　 對篩選出來的6個木聚糖水解酶基因進行了表達分析，結(jié)果在誘導組RT-PCR中均擴增獲得明亮的PCR條帶，試驗結(jié)果表明這6個基因是在木聚糖誘導下能夠進行特異表達，而在以葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時則基本不表達。特異基因RT-PCR結(jié)果進一步驗證了所構(gòu)建黑曲霉消減文庫的質(zhì)量。

11、黑曲霉消減文庫中分離得到的木聚糖特異表達基因的分離為深入研究木聚糖誘導與代謝調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。
　　 3.產(chǎn)黃青霉胞外蛋白酶的分離純化及蛋白酶缺陷型菌株的構(gòu)建
　　 采用硫銨分級沉淀、DEAE離子交換層析和分子篩層析對產(chǎn)黃青霉FS010的胞外蛋白酶進行初步的分離。SDS-PAGE電泳分析顯示產(chǎn)黃青霉FS010菌株所產(chǎn)的胞外蛋白酶種類較少，在分子量約43kDa處有1條明顯的蛋白帶，對分離純化的蛋白酶的酶學性質(zhì)進行研究，研究表

12、明該蛋白酶的最適作用溫度為35℃，最適作用pH為9.0。蛋白酶抑制劑的研究顯示該酶屬于絲氨酸蛋白酶。
　　 以黑曲霉、微紫青霉的天冬氨酸蛋白酶PepA作為檢索內(nèi)容，對Penicilliumchrysogenum的pepA同源基因進行搜索。結(jié)構(gòu)搜索到1個基因編號為8313187，蛋白編號為XP_002567415.1的基因，將其命名為pepA，該基因初步認為編碼天冬氨酸蛋白酶A，屬于酸性蛋白酶。將搜索到的基因片段的上游非編碼區(qū)和下

13、游區(qū)也進行整理，最終獲得pepA的全長序列，其中上游非編碼區(qū)長度為1099bp，下游非編碼區(qū)為563bp。
　　 體外成功構(gòu)建了產(chǎn)黃青霉天冬氨酸蛋白酶基因pepA敲除載體p△pepA，并將其轉(zhuǎn)化產(chǎn)黃青霉原生質(zhì)體，成功篩選獲得3株轉(zhuǎn)化子，經(jīng)過PCR驗證和Southern雜交證實這3株轉(zhuǎn)化子的pepA基因已經(jīng)被敲除。對3株缺轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵上清中總蛋白及蛋白酶活性進行了測定，證實轉(zhuǎn)化子△PEP14的胞外蛋白酶活性降低最顯著，相比出發(fā)菌株

14、降低了80.9％；而另外兩株轉(zhuǎn)化子的胞外蛋白酶活性比出發(fā)菌株分別降低了61.2％和40.2％。酶活測定結(jié)果表明產(chǎn)黃青霉天冬氨酸蛋白酶A的缺失能降低發(fā)酵液胞外蛋白酶活性，但發(fā)酵液總蛋白含量保持相對恒定。對pepA缺失轉(zhuǎn)化子△PEP14的遺傳穩(wěn)定性進行了研究，結(jié)果顯示△PEP14轉(zhuǎn)化子具有較好的遺傳穩(wěn)定性，傳10代后仍能保持較低胞外蛋白酶活性。
　　 4.堿性木聚糖酶基因在產(chǎn)黃青霉蛋白酶缺陷菌株中的分泌表達
　　 根據(jù)產(chǎn)黃青

15、霉中密碼子的偏愛性，利用Codon-Adaptation tool對來自于嗜堿桿菌堿性木聚糖酶基因序列xyl進行密碼子優(yōu)化。優(yōu)化后的xyl1序列的CAI值為0.99，GC含量為60.94％，比出發(fā)序列提高了61.2％。Blast分析發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的序列和原始序列核酸相似性為74％。
　　 以質(zhì)粒pUC19為載體骨架，選用產(chǎn)黃青霉酸性木聚糖酶基因(xyn)的強啟動子Pxyn及終止子Txyn序列構(gòu)建細菌堿性木聚糖酶基因表達盒，成功得到重

16、組表達載體pxyl-1。將pxyl-1轉(zhuǎn)化產(chǎn)黃青霉原生質(zhì)體，篩選獲得4株轉(zhuǎn)化子。Southern雜交及RT-PCR分析證實這4株轉(zhuǎn)化子的堿性木聚糖酶基因xyl1能夠進行特異表達。
　　 對產(chǎn)黃青霉pxyl-1轉(zhuǎn)化子XY35所產(chǎn)的木聚糖酶的酶學性質(zhì)進行了初步研究。結(jié)果證實重組堿性木聚糖酶在產(chǎn)黃青霉中可以分泌到胞外，用產(chǎn)黃青霉pxyl-1轉(zhuǎn)化子XY35發(fā)酵上清液進行了SDS-PAGE分析和堿性木聚糖酶活性測定。試驗結(jié)果顯示，與出發(fā)菌

17、株相比較，轉(zhuǎn)化子XY35胞外蛋白樣品在約41kDa處出現(xiàn)了1條蛋白帶。酶活測定結(jié)果顯示，出發(fā)菌株木聚糖酶活為254.5 U/mg，上清液總蛋白含量為0.42 mg/mL，而轉(zhuǎn)化子為1217.9 U/mg，發(fā)酵上清液總蛋白含量為0.48 mg/mL。凝膠掃描分析表明木聚糖酶占胞外總蛋白的15.9％。
　　 對轉(zhuǎn)化子XY35的木聚糖酶粗酶液與出發(fā)菌株所產(chǎn)酸性木聚糖酶的性質(zhì)進行了比較分析，結(jié)果顯示重組堿性木聚糖酶最適作用pH值為8.0

18、，而出發(fā)菌株所產(chǎn)的酶為6.0。重組酶穩(wěn)定pH范圍在6.0-11.0之間，在3-9.5范圍內(nèi)可保留80％以上酶活力，堿穩(wěn)定性較強，該菌株所產(chǎn)堿性木聚糖酶可望用于紙漿的預漂白。重組木聚糖酶和出發(fā)菌株的酸性酶的最適作用溫度均為40℃，溫度超過50℃后，重組酶的活力喪失大部分活性，到55℃，僅保留原有活性的42.3％，其耐熱穩(wěn)定性需要進一步提高。本文利用產(chǎn)黃青霉作為宿主過表達外源基因的研究為產(chǎn)黃青霉的工業(yè)育種提供了試驗范例和進行了有益的探討。高