β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因在黑曲霉中安全高效表達(dá)的研究.pdf

1、絲狀真菌具有卓越的表達(dá)和分泌能力，以及與哺乳動物相似的糖基化修飾系統(tǒng)，其安全性也廣泛為人們所接受，是表達(dá)真核基因的理想系統(tǒng)。目前，在世界范圍內(nèi)研究和開發(fā)絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)已成為重組酶制劑研究領(lǐng)域的熱點。盡管目前國內(nèi)利用木霉、曲霉發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶已經(jīng)達(dá)到了很高的生產(chǎn)水平，但是距離國際先進(jìn)水平還有一定差距。同時，生產(chǎn)的木聚糖酶并不能滿足一些特殊需要。例如，由于具有較高的木糖苷酶活性，這些木聚糖酶并不適用于低聚木糖的生產(chǎn)。通過基因工程手段表達(dá)內(nèi)

2、切木聚糖酶是解決這一問題的有效途徑。
　　 本實驗以糖化酶生產(chǎn)菌黑曲霉CICC2462為受體菌，以高表達(dá)的糖化酶基因位點為基因整合的靶位點，構(gòu)建β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶基因黑曲霉表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對黑曲霉進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，并通過在潮霉素基因表達(dá)框兩側(cè)設(shè)計順向重復(fù)序列，使其在轉(zhuǎn)化子后代中刪除潮霉素篩選標(biāo)記基因，獲得食品級工程菌。
　　 取得的主要研究結(jié)果如下:
　　 1.基因與同源臂的克隆采用PCR擴增方法，分

3、別獲得木聚糖酶基因xyn2和xynB，黑曲霉糖化酶基因的上游片段5'GLA和下游片段3GLA。
　　 2.黑曲霉表達(dá)載體的構(gòu)建采用重疊延伸PCR技術(shù)，將5'GLA、xyn2或xynB、3'GLA片段進(jìn)行拼接，得到同源重組表達(dá)框G2G或GBG，將其與黑曲霉表達(dá)載體pSZH連接，構(gòu)建木聚糖酶黑曲霉表達(dá)載體pSZH-xyn2和pSZH-xynB。
　　 3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化黑曲霉及轉(zhuǎn)化子的篩選采用凍融法將黑曲霉表達(dá)載體pSZH

4、-xyn2和pSZH-xynB轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌AGL1中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化黑曲霉CICC2462。經(jīng)PCR鑒定，xyn2基因轉(zhuǎn)化的陽性率為34.78％，xynB基因轉(zhuǎn)化的陽性率為70.15％。
　　 4.xynB基因同源重組轉(zhuǎn)化子的篩選用同源重組引物對12株陽性菌株做PCR鑒定，結(jié)果有9株可擴增出約1701bp的目的條帶，是同源重組轉(zhuǎn)化子，pSZH-xynB轉(zhuǎn)化的同源重組率為75％。在含200mmol/L潮霉素B的PDA液體培養(yǎng)基中

5、連續(xù)傳代5代后，將液體培養(yǎng)物涂在含有200mmol/L潮霉素B的PDA固體培養(yǎng)基上。挑取26個單菌落做PCR鑒定，均為純合的同源重組菌株。
　　 5.xynB基因同源重組菌株中hph基因的刪除將純合的同源重組轉(zhuǎn)化子B10-5在不含潮霉素B的PDA液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代5代后涂布于不含潮霉素B的PDA平板上，從其上挑取了534個菌落于含200mmol/L潮霉素B的PDA平板上，結(jié)果有2個菌落未生長。提取這2個菌落的基因組DNA，分別

6、用糖化酶基因引物和同源重組引物進(jìn)行PCR鑒定，可擴增出約3000bp的目的條帶，而不能擴增出1701bp的目的帶，說明這兩個菌落中的目的基因xynB仍整合在糖化酶基因位點，而與其連鎖的潮霉素基因已經(jīng)被刪除，潮霉素基因的消除效率0.3745％。該實驗結(jié)果也說明經(jīng)多次傳代后目的基因的遺傳穩(wěn)定性為100％。
　　 6.重組菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化在純合同源重組菌株中，糖化酶基因已經(jīng)被木聚糖酶基因所置換，失去了對液化淀粉的利用能力，因此對糖化