內(nèi)切型-β-葡聚糖酶基因的表達(dá).pdf

1、內(nèi)切型-β-葡聚糖酶（CMC酶）是纖維素酶的重要組分之一，在纖維素水解糖化、食品、飼料、織物水洗等領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛。本文采用基因工程技術(shù)，在內(nèi)切型-β-葡聚糖酶基因重組菌株的構(gòu)建、篩選及產(chǎn)酶等方面進(jìn)行了研究。
　　 首先，以實(shí)驗(yàn)室前期克隆得到的厭氧真菌內(nèi)切型-β-葡聚糖酶基因af1為研究對(duì)象，將目的基因與大腸桿菌表達(dá)載體pET-28a(+)連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)，獲得重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-2

2、8a(+)-af1。重組菌的適宜培養(yǎng)條件為：菌體濃度OD600為0.8時(shí)加入IPTG至終濃度為0.1mM，31℃誘導(dǎo)培養(yǎng)。采用SDS-PAGE蛋白電泳對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析，在40kDa附近得到與目的基因af1表達(dá)蛋白理論值相當(dāng)?shù)拿黠@條帶。酶學(xué)性質(zhì)研究表明，酶蛋白的最適作用條件為pH6.0，45℃，屬于中性纖維素酶。試驗(yàn)結(jié)果證明af1基因具有適于表達(dá)的完整序列。
　　 進(jìn)一步將af1基因與畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K連接，經(jīng)限制性

3、內(nèi)切酶BglⅡ線性化后，采用基因?qū)雰x將重組DNA轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115。在選擇性培養(yǎng)平板上進(jìn)行篩選，挑出六個(gè)高抗陽性轉(zhuǎn)化子。提取基因組進(jìn)行PCR鑒定，均獲得與目的基因相關(guān)的條帶，證明af1基因已整合入GS115基因組，有利于穩(wěn)定遺傳。af1基因在甲醇誘導(dǎo)下可在畢赤酵母中表達(dá)，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳分析，在52kDa附近出現(xiàn)明顯條帶。分別誘導(dǎo)培養(yǎng)篩選到的六個(gè)高抗陽性轉(zhuǎn)化子，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)酶性能基本一致．采用重組畢赤酵母在搖瓶條件

4、下分批發(fā)酵，結(jié)果顯示其產(chǎn)酶性能穩(wěn)定．在pH6.0，50℃條件下檢測CMC酶活力，發(fā)酵液中酶活在誘導(dǎo)培養(yǎng)96h左右可達(dá)到600U/mL以上。該試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步利用重組畢赤酵母生產(chǎn)中性纖維素酶奠定了基礎(chǔ)。
　　 通過試管初篩、搖瓶復(fù)篩，從各約300個(gè)里氏木霉轉(zhuǎn)化子T/af1（含有厭氧真菌內(nèi)切型-β-葡聚糖酶基因af1）和T/egⅡ(含有里氏木霉內(nèi)切型-β-葡聚糖酶基因egⅡ）中獲得了T/af1-3和T/egⅡ-5兩個(gè)優(yōu)良轉(zhuǎn)化子。對(duì)重

5、組里氏木霉T/af1-3進(jìn)行搖瓶產(chǎn)酶研究，在pH6.0，50℃條件下測得發(fā)酵液中的中性CMC酶活力可達(dá)1280U/mL,提高到同期原始菌的3.9倍；而對(duì)重組里氏木霉T/egⅡ-5進(jìn)行搖瓶產(chǎn)酶研究，在pH4.8，50℃條件下測得發(fā)酵液中的酸性CMC酶活力可達(dá)到3500 U/mL，約是同期原始菌的4.9倍。采用里氏木霉作為基因工程宿主菌具有外源基因表達(dá)水平高，產(chǎn)物易于分離提取等優(yōu)點(diǎn)，本文的研究成果在纖維素酶的定向進(jìn)化及纖維素酶高產(chǎn)菌株的構(gòu)建