β-1,3-葡聚糖酶在畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、國內(nèi)圖書分類號：Q933學(xué)校代碼：10213國際圖書分類號：579密級：公開理學(xué)碩士學(xué)位論文理學(xué)碩士學(xué)位論文β13葡聚糖酶在畢赤酵母中的表達(dá)碩士研究生：程政翔導(dǎo)師：宋金柱教授申請學(xué)位：理學(xué)碩士學(xué)科、專業(yè)：生物學(xué)所在單位：生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院答辯日期：2013年6月授予學(xué)位單位：哈爾濱工業(yè)大學(xué)哈爾濱工業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文摘要球毛殼菌（Chaetomiumglobosum）是微生物農(nóng)藥家族中重要的一員，對許多植物病害具有預(yù)防治療的作用。其中

2、，球毛殼菌所分泌的β13葡聚糖酶可以水解纖維素中的糖苷鍵，對植物病原菌有強(qiáng)烈的抑制作用。因此，由球毛殼菌中獲取β13葡聚糖酶的基因并使之高度表達(dá)，深入研究β13葡聚糖酶與病原菌的相互作用，對生物農(nóng)藥的推廣有著重要意義。本實(shí)驗(yàn)所獲得的β13葡聚糖酶的基因全長為1683bp，cDNA長度為1605bp。首先，利用含有EcI和NotI酶切位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增出目的基因cgglu。隨后，將目的基因cgglu以及表達(dá)載體pPIC9K利用EcI以及No

3、tI進(jìn)行雙酶切，再利用T4DNALigase把目的基因cgglu與表達(dá)載體pPIC9K連接，從而構(gòu)建出重組表達(dá)載體pPIC9Kcgglu。將pPIC9Kcgglu經(jīng)過Kpn2I線性化后，通過電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中。梯度電壓實(shí)驗(yàn)顯示，電壓為1000V時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高，每微克轉(zhuǎn)化子可達(dá)80個(gè)以上。從轉(zhuǎn)化子平板中隨機(jī)挑選48個(gè)轉(zhuǎn)化子，通過MD及MM平板篩選法進(jìn)行Mut以及MutS型轉(zhuǎn)化子的分辨。挑選8個(gè)Mut轉(zhuǎn)化子進(jìn)行

4、PCR檢測，證實(shí)重組表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)化進(jìn)入畢赤酵母GS115中。隨機(jī)挑選5個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并且利用SDSPAGE進(jìn)行檢測。其中4個(gè)轉(zhuǎn)化子成功分泌目的重組蛋白CGGLU，條帶大小在50kDa與85kDa之間，比理論值大小54kDa略大。酶學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果顯示，重組蛋白CGGLU最適催化溫度為45℃，誘導(dǎo)96h所產(chǎn)生的重組蛋白CGGLU酶活最高，絕對酶活值可達(dá)0.186U。抑菌試驗(yàn)顯示，重組蛋白CGGLU對三種不同植物病原菌：立枯絲核菌（