煙曲霉殼聚糖酶基因的克隆與畢赤酵母表達(dá).pdf

1、為了實(shí)現(xiàn)殼聚糖酶產(chǎn)業(yè)化的目的，本研究希望構(gòu)建一種穩(wěn)定、高效表達(dá)的工程菌。 本研究在比較傳統(tǒng)提取總RNA方法的基礎(chǔ)上針對(duì)煙曲霉 (Aspergillusfumigatus)的一些特點(diǎn)獲得一種改進(jìn)的提取總RNA的新方法，并利用這種方法從已知的產(chǎn)酶菌中提取了高質(zhì)量的總RNA。根據(jù)酶蛋白N端測(cè)序的結(jié)果結(jié)合Getaebank中發(fā)布的殼聚糖酶基因序列設(shè)計(jì)出一對(duì)引物T<,3>、T<,4>，以提得的煙曲霉總RNA為模板利用RT-PCR的手段成功

2、調(diào)取殼聚糖酶的基因。為了使以后的純化簡(jiǎn)單點(diǎn)，本項(xiàng)研究采用了畢赤酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)作為酶的表達(dá)生產(chǎn)工具。用限制性內(nèi)切酶Not Ⅰ及Avr Ⅱ雙酶切目的基因及空載體pPIC9K，用連接酶將兩者連接構(gòu)建重組載體。將構(gòu)建的載體pPIC9K-Csn克隆進(jìn)大腸桿菌DH5 α進(jìn)行陽(yáng)性克隆子的挑選和測(cè)序。將測(cè)序正確的重組載體用sal Ⅰ線性化，經(jīng)去磷酸化后電轉(zhuǎn)化入宿主菌GS115，通過(guò)重組，帶有目的基因的載體被整合到宿主菌的染色體。然后用MD平板及酵落P