土曲霉阿魏酸酯酶基因的克隆及在畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、阿魏酸酯酶是一類可降解植物細(xì)胞壁阿魏酸與木質(zhì)素及阿拉伯半糖相連的酯鍵的水解酶。能很好的解聚細(xì)胞壁，促進(jìn)木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶等纖維素酶對(duì)細(xì)胞壁的降解作用。阿魏酸酯酶可應(yīng)用于造紙、紡織、飼料、食品等輕工行業(yè)。
　　本文采用阿魏酸乙酯平板法從土壤和實(shí)驗(yàn)室菌種庫(kù)中篩選出3株產(chǎn)阿魏酸酯酶的絲狀真菌。分別編號(hào)為SD01、SD02和SD03，對(duì)3株菌分別進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并進(jìn)行了18S rDNA序列及ITS序列的克隆。菌株SD01長(zhǎng)勢(shì)迅速，菌絲與

2、培養(yǎng)基結(jié)合緊密呈墨綠色，菌落表面濕潤(rùn)，孢子梗分生孢子不超過(guò)3個(gè)，孢子彎如新月，內(nèi)有3隔室由內(nèi)向外逐步膨大，孢子隔膜較厚。菌落、孢子形態(tài)結(jié)合ITS序列鑒定，該菌株為谷子彎孢菌。菌株SD02生長(zhǎng)迅速，菌絲蔓延性強(qiáng)，在PDA培養(yǎng)基上開(kāi)始呈現(xiàn)白色絨毛狀，逐漸長(zhǎng)出金黃色孢子后期孢子轉(zhuǎn)為黃綠色，孢子蓬松易脫落。孢子頭端部膨大，分生孢子沿著次生小梗均勻排列呈現(xiàn)兩排。菌絲外側(cè)有絨毛，內(nèi)部有隔膜，是典型的黃綠曲霉特征。結(jié)合18S rDNA及 ITS序列對(duì)

3、比分析結(jié)果，認(rèn)定菌株SD02為黃曲霉。菌株SD03生長(zhǎng)遲緩，需要2周分生孢子方鋪滿平板。菌絲致密，在PDA平板上初期白色，后逐漸分化出土褐色孢子，孢子松散易脫落。菌落邊緣呈鋸齒狀，整體呈現(xiàn)螺紋狀。菌落、孢子形態(tài)結(jié)合18S rDNA及 ITS序列，認(rèn)定菌株SD03為：土曲霉（Aspergillus terreus）。
　　本研究以土曲霉SD03作為出發(fā)菌株，采用PCR擴(kuò)增得到土曲霉SD03的阿魏酸酯酶基因序列，序列分析顯示其中包含兩

4、個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，總長(zhǎng)度為787bp。采用重疊拼接PCR將其編碼阿魏酸酯酶基因的兩個(gè)外顯子進(jìn)行拼接，獲得阿魏酸酯酶DNA序列，測(cè)序顯示阿魏酸酯酶DNA序列長(zhǎng)度為723bp，共編碼341個(gè)氨基酸，其中和NCBI報(bào)道的土曲霉阿魏酸酯酶蛋白序列有兩個(gè)氨基酸的差異，分別是120位的纈氨酸和第121位絲氨酸。利用EcoRI+Avr II雙酶切將土曲霉SD03的阿魏酸酯酶DNA基因插入到表達(dá)載體pPIC9K中成功獲得了畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9

5、K-fae，表達(dá)載體的成功構(gòu)建為下一步的表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。表達(dá)載體pPIC9K-fae，分別經(jīng)Sal I和Bgl II線性化，利用電轉(zhuǎn)化法和化學(xué)轉(zhuǎn)化法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出后涂布在G418梯度平板(最高濃度6mmol/L)進(jìn)行抗性篩選，結(jié)果篩出獲得64株高抗性轉(zhuǎn)化子。對(duì)64株轉(zhuǎn)化子進(jìn)行試管誘導(dǎo)發(fā)酵試驗(yàn)，依據(jù)發(fā)酵液在阿魏酸乙酯平板上產(chǎn)生透明圈的情況篩選出16株有明顯透明圈的轉(zhuǎn)化子。利用pPIC9K表達(dá)盒引物及fae基因特異引物對(duì)其進(jìn)行PCR鑒

6、定篩選，結(jié)果獲得6株轉(zhuǎn)化子。對(duì)篩選獲的6株pPIC9K-fae畢赤酵母轉(zhuǎn)化子進(jìn)行發(fā)酵性能研究，在甲醇誘導(dǎo)的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)4d后發(fā)酵活力達(dá)到最高，以對(duì)硝基阿魏酸苯酚酯為底物，利用UV法410nm下測(cè)定對(duì)硝基酚的吸收值變化量，來(lái)測(cè)定轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液的酶活，其中轉(zhuǎn)化子G3菌株的發(fā)酵液活性最高，可達(dá)12U/L。對(duì)G3菌株的發(fā)酵上清進(jìn)行SDS-PAGE的電泳分析，結(jié)果在分子量大小32Kda左右有1條明顯的條帶。對(duì)土曲霉阿魏酸酯酶基因的外源表達(dá)有助于