海藻糖合酶基因在畢赤酵母中的克隆和表達.pdf

1、海藻糖因其獨特的生物學(xué)功能使得其近年來在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等行業(yè)中被廣泛使用，而專一轉(zhuǎn)化生產(chǎn)海藻糖的海藻糖合酶是一種分子內(nèi)的葡糖苷轉(zhuǎn)移酶，可以將麥芽糖中的α-1,4糖苷鍵轉(zhuǎn)化成α-1,1糖苷鍵從而生成海藻糖，利用海藻糖合酶一步法生成海藻糖具有工藝流程短，易調(diào)控等優(yōu)勢，使海藻糖合酶在工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)中有優(yōu)良的開發(fā)應(yīng)用前景。
　　本論文通過PCR方法利用特異引物擴增出全長2067bp的海藻糖合酶基因，利用基因重組技術(shù)將目的基因片段克隆至

2、表達載體pPICZαA的EcoRⅠ和XbaⅠ位點之間，構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒 pPICZαA-TreS。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母 GS115和SMD1168，通過博來霉素梯度濃度進行高拷貝轉(zhuǎn)化子篩選，在1000μg/ml的博來霉條件下篩選到單菌落。之后對得到的高拷貝菌株進行表型鑒定，鑒定結(jié)果表明所篩的單菌落均為 Mut+。重組菌株搖瓶培養(yǎng)下經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達，表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和HPLC分析表明，在胞內(nèi)檢測到蛋白分子量約76kDa的特異條帶

3、并具有酶學(xué)活性，酶活分別為4214.7和4354.6 U/mL，在兩株菌發(fā)酵液中均未檢測到重組目的蛋白和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。
　　通過改變培養(yǎng)溫度，甲醇誘導(dǎo)濃度，pH，誘導(dǎo)時間，裝液量五個培養(yǎng)條件以及發(fā)酵罐上高密度培養(yǎng)考查對重組蛋白分泌表達的影響，結(jié)果顯示培養(yǎng)條件的改變對目的蛋白分泌表達沒有決定性影響，目的蛋白在不同培養(yǎng)條件下載胞內(nèi)成功表達。通過實驗結(jié)果分析和綜合資料表明影響蛋白表達的因素是多方面的，由于目前外源蛋白的分泌途徑中加工修飾的分