雪蓮PEBP基因在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達.pdf

1、雪蓮PEBP基因是本實驗室分離出的新抗寒相關基因，共有510個核苷酸，網(wǎng)上進行BLAST對比，與擬南芥(Arabidopsis thaliana)中的磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白基因類似，相似性81﹪。本實驗以實驗室構建的Teasy-PEBP質(zhì)粒為模板，擴增PEBP基因，克隆到表達載體pET30(+)和pPIC9k并導入大腸桿菌BL21(DE3)和畢赤酵母(Pichiapastoris)GSll5細胞內(nèi)表達，純化表達產(chǎn)物，優(yōu)化表達條件，主要結(jié)果

2、如下： 根據(jù)pET30(+)多克隆位點設計PEBP基因特異性引物，引入EcoR I和Nco I酶切位點，以Teasy-PEBP質(zhì)粒為模板，擴增PEBP基因，連接到原核表達載體pET30(+)上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)表達菌株BL21(DE3)，在低溫下，低濃度IPTG誘導融合蛋白表達，純化表達產(chǎn)物，Westernblot鑒定目的蛋白，SDS-PAGE分析：其相對分子量約為28KD，與預期相符，表達量約占菌體蛋白的26.8﹪，并且通過親和層析

3、純化了重組融合蛋白，Western blot鑒定為陽性。 根據(jù)pPIC9k多克隆位點設計PEBP基因引物，分別加入EcoR I和Not I酶切位點，以Teasy-PEBP質(zhì)粒為模板，擴增PEBP基因，克隆到表達載體pPIC9k，得到重組質(zhì)粒并命名為pPIC9k-PEBP，將pPIC9k-PEBP用Sal I進行酶切，線性化后的pPIC9k-PEBP以電轉(zhuǎn)化法導入到酵母GS115細胞中，利用MM和MD平板篩選Mut<'s>(met

4、hanol utilization slow)表型，PCR鑒定重組酵母菌株，乙醇誘導表達。SDS-PAGE分析：其相對分子量約為20KD，蛋白表達量可占總蛋白的90﹪，上清液抗凍檢測表明，PEBP能降低液體的冰點，具有一定的抗凍作用。 優(yōu)化重組質(zhì)粒pPIC9k-PEBP在畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115中的表達條件，初步得到最佳的重組蛋白表達條件為：誘導劑甲醇濃度為0.5﹪，誘導培養(yǎng)基的PH為6.0，誘導溫度為