丙型肝炎病毒核心蛋白在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus，HCV)感染是導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化和肝癌的重要原因之一。目前尚無有效的疫苗及治療藥物，對HCV感染的早期診斷是控制HCV傳播的重要手段。 HCV感染的臨床診斷途徑有：檢測血清HCVRNA、HCV抗體及HCV抗原。目前PCR檢測HCVRNA是HCV診斷最靈敏、特異的方法，但其操作復(fù)雜，易造成污染，且價(jià)格昂貴，不適于大規(guī)模的篩查應(yīng)用。HCV患者血清中HCV抗原水平很低，常規(guī)免疫學(xué)方法難以

2、獲得陽性結(jié)果。故HCV診斷最常用的方法是利用HCV特異性蛋白質(zhì)抗原來篩查血清中HCV抗體。 HCV核心蛋白(Core蛋白)高度保守且有很強(qiáng)的免疫原性，可誘發(fā)高水平的特異性體液免疫及細(xì)胞免疫，是HCV診斷試劑中必不可少的組分之一。近年來Core蛋白先后在大腸桿菌中獲得了表達(dá)，但是大腸桿菌不具有真核生物的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和蛋白質(zhì)的加工修飾能力，表達(dá)的蛋白往往形成的包涵體，需要經(jīng)過變性、復(fù)性等處理才能應(yīng)用。與大腸桿菌相比，畢赤酵母是單

3、細(xì)胞真核生物，既具有生長快的特點(diǎn)，又能有效克服大腸桿菌系統(tǒng)缺乏蛋白翻譯后加工、修飾的不足，表達(dá)外源蛋白可分泌到胞外，便于產(chǎn)品的分離純化。因此本研究在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)Core蛋白并構(gòu)建其畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，初步對兩個(gè)系統(tǒng)表達(dá)的Core蛋白進(jìn)行對比。 將克隆有Core基因的原核表達(dá)載體pBVIL1-Core轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101，溫度誘導(dǎo)表達(dá)Core蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE及Western-Blot分析；同時(shí)通過PCR方法擴(kuò)增Co

4、re基因，克隆入表達(dá)載體pPICZaA，篩選陽性克隆pPICZaA-Core。將經(jīng)過酶切鑒定和測序正確的陽性克隆電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中，挑取酵母轉(zhuǎn)化單菌落，接種于BMGY培養(yǎng)基，30℃、250r/min培養(yǎng)至OD600=2.0時(shí)室溫1,500r/min離心5min，用BMMY培養(yǎng)基重懸菌體使OD600=1.0，重新放入搖床進(jìn)行誘導(dǎo)。每24h補(bǔ)加甲醇至終濃度為1.0％，連續(xù)誘導(dǎo)72h，誘導(dǎo)后上清進(jìn)行Western-Blot分析。

5、 結(jié)果顯示pBVIL1-Core的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析出現(xiàn)一條約31KD的帶，與預(yù)期融合蛋白的分子量相符，表達(dá)蛋白存在于包涵體中且表達(dá)量占菌體總蛋白的20％，Western-blot顯示誘導(dǎo)后菌體在相應(yīng)位置出現(xiàn)特異性雜交帶，表明在大腸桿菌中以包涵體的形式表達(dá)了Core蛋白；以PCR方法從質(zhì)粒PBRTM/HCV中擴(kuò)增出一條369bp的片斷，經(jīng)測序與文獻(xiàn)一致。Western-Blot分析pPICZaA-Core轉(zhuǎn)化酵母菌誘導(dǎo)72