不同缺失突變的丙型肝炎病毒核蛋白在大腸桿菌中的表達(dá).pdf

1、丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)感染已成為全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題。WHO1999年統(tǒng)計(jì)表明，全球目前約有1.7億人感染HCV，約占全球人口的3％。據(jù)估計(jì)，每年新增HCV感染人數(shù)約為300～400萬(wàn)。丙型肝炎最大的特點(diǎn)是高度慢性化，慢性化率為50％～85％。一部分HCV慢性感染者可演化成肝硬化、肝癌等終末期肝病。丙型肝炎病毒高度變異的特性給疫苗的研制帶來(lái)了極大的困難。 由于HCV核蛋白相對(duì)保守，不同型和亞型的H

2、CV株之間有共同的體液和細(xì)胞免疫抗原位點(diǎn)，長(zhǎng)期以來(lái)作為HCV疫苗的備選抗原一直是研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，HCV核蛋白可以誘導(dǎo)CTL反應(yīng)及ADCC，但完整的核蛋白在體外表達(dá)水平低，用完整的核蛋白基因進(jìn)行DNA免疫不能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平的CTL反應(yīng)。研究者應(yīng)用多種策略對(duì)核蛋白DNA疫苗進(jìn)行優(yōu)化，但仍未達(dá)到理想效果。核蛋白DNA疫苗在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量不足和核蛋白本身對(duì)免疫功能的抑制可能是影響核蛋白特異性免疫的兩個(gè)重要因素。我室曾通過(guò)對(duì)核蛋白自身進(jìn)行改

3、造研究，發(fā)現(xiàn)核蛋白羧基末端20位氨基酸缺失能提高其真核表達(dá)水平，第60～80位氨基酸缺失可明顯提高DNA免疫后核蛋白特異性淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和CTL反應(yīng)。為了進(jìn)一步證實(shí)羧基末端20位氨基酸以及第60～80位氨基酸缺失突變對(duì)核蛋白DNA免疫的作用并研究其作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了3種不同缺失突變的核蛋白和完整核蛋白的原核表達(dá)載體并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)。 方法：用PCR方法擴(kuò)增1b型HCV核蛋白的全長(zhǎng)及3種不同缺失突變的基因片段，對(duì)應(yīng)氨

4、基酸分別為C573：1-191aa、C510：1-59aa+81-191aa、C507：1-169aa、C444：1-59aa+81-169aa。將其克隆到高效表達(dá)載體pRSET-A中構(gòu)建成重組質(zhì)粒(pRSET-C573、pRSET-C510、pRSET-C507、pRSET-C444)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21(DE3)pLysS。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6×His融合蛋白，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE及Western-blot檢測(cè)和鑒定。