大腸桿菌抗原基因faeG、fedF在大腸桿菌中的表達(dá)及對小鼠免疫效果的研究.pdf

1、仔豬腹瀉一直是困擾養(yǎng)豬業(yè)的難題之一,每年給畜牧生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失。產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)和產(chǎn)vero細(xì)胞毒素性大腸桿菌(Votoxigenic Escherichia coli,VTEC)是引起仔豬腹瀉和水腫病的兩種重要的大腸桿菌,其致病性主要與粘附素和所產(chǎn)生的腸毒素有關(guān)。K88和F18是引起仔豬腹瀉的兩個重要的菌毛抗原。K88由fae基因簇編碼的蛋白亞基構(gòu)成

2、,FaeG是K88菌毛蛋白中具有粘附功能的蛋白亞基;F18則有fed基因簇編碼的蛋白亞基構(gòu)成,FedF是F18菌毛蛋白中具有粘附功能的蛋白亞基。本研究在克隆faeG基因和fedF基因的基礎(chǔ)上,在大腸桿菌中分別表達(dá)了FaeG和FedF蛋白,并將表達(dá)產(chǎn)物免疫小鼠,觀察其免疫活性,獲得了如下主要結(jié)果:
　　 (1)根據(jù)GenBank上faeG基因序列(M25302)和fedF基因序列(AY970818),設(shè)計了兩對克隆引物5PinF4

3、、3PinF4和5PinF18、3PinF18。分別以大腸桿菌K88和F18菌株為模板,采用PCR方法擴增得到faeG和fedF全長基因片段,并將其與克隆載體連接,獲得重組克隆質(zhì)粒pGEM-faeG和pGEM-fedF。測序結(jié)果表明:faeG成熟肽基因全長852bp,其中N端前20個氨基酸為信號肽,成熟肽由264個氨基酸殘基組成,所得faeG基因核甘酸序列與M25302同源性為99％,氨基酸序列同源性為98％;fedF成熟肽基因全長90

4、8bp,其中N端前20個氨基酸為信號肽,成熟肽由282個氨基酸殘基組成,所得fedF基因核甘酸序列與AY970818同源性為98％,氨基酸序列同源性為97％。
　　 (2)在克隆的基礎(chǔ)上,分別將faeG和fedF基因定向插入到大腸桿菌BL21融合表達(dá)載體pET-30a(+)中,經(jīng)轉(zhuǎn)化和篩選分別獲得了含重組表達(dá)質(zhì)粒pET-faeG和pET-fedF的陽性表達(dá)菌E.coli[pET-faeG]和E.coli[pET-fedF]。SD

5、S-PAGE電泳顯示,FaeG和FedF蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá)。
　　 (3)將40只BALB/c小鼠分成4個組,每組10只,分別在試驗第1、2、3 d和第20、21、22 d進行口服免疫PBS、E.coli[pET]、E.coli[pET-faeG]、E.coli[pET-fedF],第5組用E.coli[pET-fedF]免疫10只ICR小鼠。第40 d用大腸桿菌進行攻毒試驗以評價活重組菌的免疫保護效果。結(jié)果表明:E.co