大腸桿菌基因工程資料

1、基因工程原理,何光源2016-04-05,第九章 大腸桿菌基因工程,第一節(jié) 大腸桿菌表達(dá)體系第二節(jié) 大腸桿菌的表達(dá)載體第三節(jié) 克隆的真核基因在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá),2024/1/23,第一節(jié) 大腸桿菌表達(dá)體系,2024/1/23,第一節(jié) 大腸桿菌表達(dá)體系,大腸桿菌表達(dá)體系克隆基因正確表達(dá)的基本條件,2024/1/23,大腸桿菌表達(dá)體系,基因工程的重要目標(biāo)之一是，制備按其它方法難以生產(chǎn)的大量純化的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，為此就需

2、要有一種能夠高水平表達(dá)異源蛋白質(zhì)或重組蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)。而良好的表達(dá)系統(tǒng)的選擇要考慮多方面的因素，如寄主細(xì)胞的生長(zhǎng)特性、蛋白質(zhì)產(chǎn)物轉(zhuǎn)譯后的修飾與生物活性，以及異源蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和分泌方式等。目前被選作表達(dá)異源蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)有細(xì)菌（包括大腸桿菌和枯草芽孢桿菌）、酵母、昆蟲(chóng)、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。,2024/1/23,大腸桿菌表達(dá)體系,比較而言，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有明顯的優(yōu)越性：對(duì)大腸桿菌的背景知識(shí)，特別是基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理有深刻

3、的了解；一種安全的基因工程實(shí)驗(yàn)體系，擁有各類(lèi)適用的寄主菌株和不同類(lèi)型的載體；許多克隆的真核基因都可以在大腸桿菌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)有效、高水平的表達(dá)；培養(yǎng)方便、操作簡(jiǎn)單、成本低廉，易于進(jìn)行工業(yè)化批量生產(chǎn)。,2024/1/23,大腸桿菌表達(dá)體系,大腸桿菌中表達(dá)體系表達(dá)真核基因的不足：真核基因在結(jié)構(gòu)上同原核基因之間存在著很大的差別，在大腸桿菌細(xì)胞中不可能具有為真核RNA加工剪輯所需要的酶體系，真核基因很難直接在大腸桿菌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)功能性表達(dá)；

4、真核基因的轉(zhuǎn)錄信號(hào)同原核不同。細(xì)菌的RNA聚合酶不能識(shí)別真核啟動(dòng)子；外源基因可能含有具有大腸桿菌轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)功能的核苷酸序列。真核基因mRNA的分子結(jié)構(gòu)同細(xì)菌有所差異，影響真核基因mRNA穩(wěn)定性和同細(xì)菌核糖體相結(jié)合的能力，從而阻礙正常的轉(zhuǎn)錄和翻譯；,2024/1/23,大腸桿菌表達(dá)體系,許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，都要經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)譯后的加工修飾（正確折疊和組裝），而大多數(shù)的修飾作用在細(xì)菌細(xì)胞中并不存在；細(xì)菌的蛋白酶，能夠識(shí)別外來(lái)的真核基因所

5、表達(dá)的蛋白質(zhì)分子，將其降解。,2024/1/23,大腸桿菌表達(dá)體系,為了克服上述這些問(wèn)題，已經(jīng)發(fā)展出了許多種不同的方法：將克隆的真核基因插入到原核啟動(dòng)子的下游附近部位，如大腸桿菌Lac操縱子的lac啟動(dòng)子，Trp操縱子的trp啟動(dòng)子及tac啟動(dòng)子，λ噬菌體的PL和PR啟動(dòng)子以及pBR322載體的β-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子從真核細(xì)胞中分離完成加工的mRNA，使用反轉(zhuǎn)錄酶合成出cDNA，并連接到適當(dāng)?shù)妮d體上，可以克服真核基因的間隔子問(wèn)題；根據(jù)

6、蛋白質(zhì)的氨基酸序列，應(yīng)用化學(xué)方法合成出不帶間隔序列的寡聚脫氧核糖核酸的短片段；通過(guò)引進(jìn)突變的的方法消除細(xì)菌中存在的能降解外源真核蛋白質(zhì)的蛋白酶分子。,2024/1/23,克隆基因正確表達(dá)的基本條件,最基本條件：能進(jìn)行正常的轉(zhuǎn)錄和翻譯，在正常情況下還與翻譯后加工及新生多肽在細(xì)胞中的分布有關(guān)。重要條件編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物應(yīng)能維持正常的穩(wěn)定性；具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)；具有克隆基因的功能（強(qiáng)）啟動(dòng)子； 插入序列的正確取向,2024/1/23

7、,第二節(jié) 大腸桿菌的表達(dá)載體,2024/1/23,第二節(jié) 大腸桿菌的表達(dá)載體,大腸桿菌載體系統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)載體的基本成分常用的大腸桿菌表達(dá)載體,2024/1/23,大腸桿菌載體系統(tǒng),容量：分子較小，可攜帶比較大的DNA片段；復(fù)制：能獨(dú)立于染色體而進(jìn)行自主高效的復(fù)制； 酶切位點(diǎn)：有盡可能多的多種限制酶切位點(diǎn)，但每一種限制酶又要最少的切割位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn) multiple cloning sites，MCS）； 標(biāo)記：有適合的

8、標(biāo)記，易于選擇；安全性：要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于在某些實(shí)驗(yàn)室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制等；表達(dá)：有時(shí)還要求載體要能啟動(dòng)外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，并且盡可能是高效的表達(dá)。,2024/1/23,大腸桿菌克隆載體,2024/1/23,大腸桿菌表達(dá)載體,2024/1/23,大腸桿菌表達(dá)載體的基本成分,組 成 部 分啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄終止子翻譯起始序列翻譯增強(qiáng)子翻譯終止子,2024/1/23,,啟動(dòng)子最佳啟動(dòng)子具備的條件：必須是一種強(qiáng)啟動(dòng)子

9、，能夠使克隆基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白的10%~30%以上；應(yīng)能呈現(xiàn)出一種低限的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平，具有高度抑制性（抑制型啟動(dòng)子）；應(yīng)是誘導(dǎo)型的，能通過(guò)簡(jiǎn)單的方式使用廉價(jià)的誘導(dǎo)物得以誘導(dǎo)（誘導(dǎo)型啟動(dòng)子）。,2024/1/23,,轉(zhuǎn)錄終止子轉(zhuǎn)錄終止子能增強(qiáng)mRNA分子的穩(wěn)定性，從而提高蛋白質(zhì)產(chǎn)物的水平。啟動(dòng)子封堵作用：由一個(gè)上游啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄作用，當(dāng)其通過(guò)下游啟動(dòng)子時(shí)，會(huì)使該啟動(dòng)子的功能受到抑制，這種由一個(gè)啟動(dòng)子的功能活性抑

10、制另一個(gè)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的現(xiàn)象,2024/1/23,,翻譯起始序列 5’-末端結(jié)構(gòu)特征，決定mRNA的轉(zhuǎn)譯起始效率。 在核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）的序列結(jié)構(gòu)中，增加腺嘌呤和胸腺嘧啶脫氧核苷殘基含量的比例，誘發(fā)堿基發(fā)生定點(diǎn)突變；或使用轉(zhuǎn)譯偶聯(lián)系統(tǒng)進(jìn)行克隆基因表達(dá),2024/1/23,,翻譯增強(qiáng)子顯著的增加異源基因在大腸桿菌中的表達(dá)效率翻譯終止子 mRNA轉(zhuǎn)譯終止必須存在終止密碼子。 大腸桿菌偏愛(ài)終止子UAA，尤其是在其

11、后加上U形成UAAU四聯(lián)核苷酸的情況下，轉(zhuǎn)譯終止的效率將進(jìn)一步的增強(qiáng)。,2024/1/23,常用的大腸桿菌表達(dá)載體,Lac啟動(dòng)子的表達(dá)載體Trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體PL啟動(dòng)子的表達(dá)載體,2024/1/23,Lac啟動(dòng)子的表達(dá)載體,理論上，凡是具有包括控制區(qū)段在內(nèi)的lac操縱子的質(zhì)粒，都具備了用作克隆基因表達(dá)載體的基本條件；突出特點(diǎn)：含有編碼β-半乳糖苷酶的lacZ基因片段；外源DNA片段插入到這個(gè)啟動(dòng)子之后，同時(shí)保持著lacZ基因固

12、有的讀碼結(jié)構(gòu)時(shí)，重組質(zhì)粒就會(huì)合成出一種由外源克隆基因編碼的多肽和β-半乳糖苷酶組成的融合蛋白質(zhì)。,2024/1/23,Trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體,優(yōu)點(diǎn)：誘導(dǎo)型，所合成的蛋白質(zhì)產(chǎn)量高于Lac啟動(dòng)子表達(dá)載體系統(tǒng)。生產(chǎn)α-干擾素和γ-干擾素三啟動(dòng)子串聯(lián)單元表達(dá)效率高于單啟動(dòng)子單元。,2024/1/23,PL啟動(dòng)子的表達(dá)載體,使用最廣泛的大腸桿菌表達(dá)載體之一cI基因存在一個(gè)溫度敏感突變等位基因。42℃時(shí)，阻遏蛋白失活；28~30 ℃時(shí)，

13、PL啟動(dòng)子完全被阻遏蛋白抑制。通過(guò)改變溫度來(lái)控制PL啟動(dòng)子的開(kāi)關(guān),2024/1/23,第三節(jié) 克隆的真核基因在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá),2024/1/23,第三節(jié) 克隆的真核基因在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá),大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建策略基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對(duì)策,2024/1/23,,外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞的表達(dá)部位細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)周質(zhì)中表達(dá)胞外表達(dá),2024/1/23,大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建策略,包涵體型異源蛋白的表達(dá)分泌

14、型異源蛋白的表達(dá)融合型異源蛋白的表達(dá)寡聚型異源蛋白的表達(dá)整合型異源蛋白的表達(dá)蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建,2024/1/23,包涵體型異源蛋白的表達(dá),包涵體及其性質(zhì)包涵體（Inclusion Bodies，IB）：特定生長(zhǎng)條件下，大腸桿菌能積累特殊生物大分子，在細(xì)胞內(nèi)致密集聚，被膜包裹/無(wú)膜裸露的水不溶性的結(jié)構(gòu)。富含蛋白質(zhì)，含少量的DNA、RNA和脂多糖氨基酸類(lèi)似物：多見(jiàn)于含有氨基酸類(lèi)似物培養(yǎng)基中，由其合成的蛋白質(zhì)喪失

15、其理化特性和生物功能，集聚形成包涵體。由高效表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白質(zhì)，后者常以包涵體形式存在于細(xì)胞內(nèi),2024/1/23,包涵體型異源蛋白的表達(dá),包涵體表達(dá)目的蛋白的優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作水難溶性，密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成分菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過(guò)高速離心，即可將重組異源蛋白從細(xì)菌裂解物中分離出來(lái)一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 形成包涵體之后，大腸桿菌的蛋白酶對(duì)

16、異源重組蛋白的穩(wěn)定性已構(gòu)不成威脅蛋白質(zhì)沒(méi)有活性，不會(huì)使寄主細(xì)胞受傷害,2024/1/23,包涵體型異源蛋白的表達(dá),蛋白質(zhì)的產(chǎn)量高二硫鍵的斷裂以及轉(zhuǎn)譯修飾作用的喪失，導(dǎo)致外源基因編碼的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中超量表達(dá)表達(dá)的質(zhì)粒載體構(gòu)建比較簡(jiǎn)單,2024/1/23,包涵體型異源蛋白的表達(dá),包涵體表達(dá)目的蛋白的缺點(diǎn)：變性復(fù)性操作：以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失原有生物活性，無(wú)正確空間構(gòu)象，必須通過(guò)有效的變性復(fù)性操作，回收具有生物活性的目標(biāo)蛋

17、白。技術(shù)難題--變復(fù)性操作的效率，尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白中的Cys殘基數(shù)目較高時(shí)，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)?，一般不超過(guò)30%N-末端存在甲硫氨酸,影響蛋白質(zhì)的真實(shí)性蛋白質(zhì)種類(lèi)多，純化比較復(fù)雜,2024/1/23,包涵體型異源蛋白的表達(dá),以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的操作包涵體的形成：若未進(jìn)行特殊設(shè)計(jì)（如分泌型表達(dá)或融合型表達(dá)），外源基因在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白量占細(xì)胞總蛋白量20%以上時(shí)，傾向于形成包涵體基因操作關(guān)鍵--選擇高表達(dá)的載體

18、高表達(dá)率---包涵體法的優(yōu)勢(shì),2024/1/23,包涵體的變性與復(fù)性操作,蛋白質(zhì)變性復(fù)性的動(dòng)力學(xué)原理：N 天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)U 變性狀態(tài)的蛋白質(zhì)C 共價(jià)修飾的蛋白質(zhì)A 集聚狀態(tài)的蛋白質(zhì)I 有效變復(fù)性過(guò)程中的中間狀態(tài)X 脫離有效變復(fù)性過(guò)程而進(jìn)入集聚的中間狀態(tài),細(xì)菌內(nèi)，集聚狀態(tài)和共價(jià)修飾的蛋白質(zhì)不能進(jìn)入復(fù)性過(guò)程，無(wú)活性，包涵體中蛋白質(zhì)屬于這兩種狀態(tài)復(fù)性操作：在體外進(jìn)行人工變性（解除共價(jià)修飾和驅(qū)散集聚體）,2024/1

19、/23,包涵體的變性與復(fù)性操作,包涵體的溶解與變性：拆開(kāi)錯(cuò)配的二硫鍵和次級(jí)鍵人工條件下，使包涵體溶解、重新進(jìn)入復(fù)性途徑。試劑和條件：清洗劑 SDS、正十二醇肌氨酸，廉價(jià)，但影響復(fù)性和純化促溶劑 鹽酸胍、尿素，前者昂貴，尿素便宜，但常被自發(fā)形成的氰酸鹽污染，后者能與多肽鏈中的氨基反應(yīng)混合溶劑 尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用，溶解力增強(qiáng)極端pH 廉價(jià)，但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反應(yīng),2024/1/2

20、3,包涵體的變性與復(fù)性操作,包涵體的復(fù)性與重折疊（refolding）：將多肽鏈中被拆開(kāi)的游離巰基重新折疊通過(guò)次級(jí)鍵的形成使蛋白質(zhì)復(fù)性,2024/1/23,包涵體的變性與復(fù)性操作,包涵體的復(fù)性與重折疊（refolding）：復(fù)性操作一步稀釋法，蛋白復(fù)性與濃度無(wú)關(guān)，但集聚與濃度關(guān)系很大分段稀釋法，逐步降低變性劑的濃度，防止二次集聚試劑添加法，精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+蛋白修飾法，氨基檸檬酸酐?；鞍讕ж?fù)電，

21、抑制集聚產(chǎn)物隔離法，將變性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞分子伴侶法，GroEL、GroES、DnaK，固定化，共表達(dá),2024/1/23,包涵體的變性與復(fù)性操作,包涵體的復(fù)性與重折疊（refolding）：二硫鍵形成在包涵體變性體系中，始終存在著還原劑，使多肽鏈中的巰基保持還原狀態(tài)，防止二硫鍵錯(cuò)配導(dǎo)致嚴(yán)重的集聚。在變性操作結(jié)束后，這些游離型的巰基必須重新配對(duì)形成二硫鍵，此時(shí)多肽鏈也重新發(fā)生折疊。形成二硫鍵的方式：化學(xué)氧化法（A

22、）需要電子受體，最廉價(jià)的電子受體為空氣，二硫鍵形成是隨機(jī)的，僅適用于那些不含游離半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)的重折疊二硫鍵交換（B）需要還原型和氧化型谷胱甘肽（GSH和GSSG），二硫鍵形成相對(duì)特異，因此適用性較廣，重折疊效果好,2024/1/23,分泌型異源蛋白的表達(dá),大腸桿菌中表達(dá)的異源蛋白的定位可溶性或不溶性（包涵體）狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中；通過(guò)運(yùn)輸或分泌方式定位于細(xì)胞周質(zhì)；穿過(guò)外膜進(jìn)入培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)分泌的前提條件--N端信號(hào)肽序列

23、的存在,2024/1/23,分泌表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)：,目的蛋白穩(wěn)定性高 重組人胰島素原若分泌到細(xì)胞周質(zhì)中，其穩(wěn)定性大約是細(xì)胞質(zhì)中10倍目的蛋白易于分離目的蛋白末端完整 相當(dāng)多的真核生物成熟蛋白N端不含甲硫氨酸殘基。這些真核基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，蛋白質(zhì)N端的甲硫氨酸殘基不能被切除。將外源基因與大腸桿菌的信號(hào)肽編碼序列重組在一起，實(shí)現(xiàn)分泌型表達(dá)，其N(xiāo)端的甲硫氨酸殘基便可在信號(hào)肽的剪切過(guò)程中有效除去,2024/1/23,分泌表達(dá)形式的缺

24、點(diǎn)：,大腸桿菌的蛋白分泌機(jī)制并不健全：外源真核生物 基因很難在大腸桿菌中進(jìn)行分泌型表達(dá)少數(shù)外源基因能分泌表達(dá)，但表達(dá)率通常要比包涵體方式低很多產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌并不普遍,2024/1/23,蛋白質(zhì)的分泌機(jī)制,原核細(xì)菌周質(zhì)中含有多種分子伴侶可阻止分泌蛋白的隨機(jī)折疊，分泌在細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中的重組蛋白很少形成分子間的二硫鍵交聯(lián)；與包涵體相比，分泌型重組蛋白具有較高比例的正確構(gòu)象，生物活性的回收率增加，且對(duì)蛋白酶不敏感

25、,2024/1/23,分泌型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建,絕大多數(shù)革蘭氏陰性菌不能將蛋白質(zhì)直接分泌到胞外；部分革蘭氏陰性菌能將細(xì)菌的抗菌蛋白（細(xì)菌素）分泌到培養(yǎng)基中，這一過(guò)程嚴(yán)格依賴(lài)于細(xì)菌素釋放蛋白，它激活定位于內(nèi)膜上的磷酸酯酶，導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)外膜的通透性增大；將細(xì)菌素釋放蛋白編碼基因克隆在一個(gè)合適質(zhì)粒上，構(gòu)建完全分泌型受體細(xì)胞另一種攜帶大腸桿菌信號(hào)肽編碼序列和目的基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化完全分泌型受體細(xì)胞，使用相同性質(zhì)的啟動(dòng)子介導(dǎo)目的基因的轉(zhuǎn)錄

26、，實(shí)現(xiàn)目的蛋白從重組大腸桿菌中的完全分泌,2024/1/23,,Secretion Cloning Vector,2024/1/23,融合型異源蛋白的表達(dá),異源蛋白的直接表達(dá) 融合蛋白：將外源基因與受體菌自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起，作為一個(gè)開(kāi)放閱讀框架進(jìn)行表達(dá)，這種雜合基因表達(dá)出的蛋白質(zhì)為融合蛋白；受體細(xì)菌的蛋白部分位于N端，異源蛋白位于C端；回收異源蛋白：雜合基因上引入蛋白酶切位點(diǎn)或化學(xué)試劑特異性斷裂位點(diǎn)，在體外從純化的融合

27、蛋白分子中釋放回收異源蛋白,2024/1/23,融合表達(dá)蛋白的優(yōu)缺點(diǎn),目的蛋白穩(wěn)定性高 尤其對(duì)分子量較小的多肽效果更佳目的蛋白易于分離 利用受體蛋白成熟的抗體、配體、底物進(jìn)行親和層析，可以快速獲得純度較高的融合蛋白目的蛋白表達(dá)率高 與受體蛋白共用一套完善的表達(dá)元件目的蛋白溶解性好 由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞內(nèi)形成良好的空間構(gòu)象，且大多具有水溶性目的蛋白需要回收 融合蛋白需要裂解和進(jìn)一步分離，才能獲目的蛋白。

28、在實(shí)際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要的成本往往就在該工段,2024/1/23,融合型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建,融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建原則：受體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基因能高效表達(dá)，且其表達(dá)產(chǎn)物可以通過(guò)親和層析進(jìn)行特異性簡(jiǎn)單純化；外源基因應(yīng)裝在受體蛋白編碼基因的下游，為融合蛋白提供終止密碼子；盡可能避免融合蛋白兩種組份的分子量過(guò)于接近，為目的蛋白分離回收創(chuàng)造條件，并不需要完整的受體結(jié)構(gòu)基因；兩個(gè)結(jié)構(gòu)基因拼接位點(diǎn)處的序列設(shè)計(jì)十分重要，直接決定著融合蛋白的裂解工

29、藝兩個(gè)蛋白編碼序列應(yīng)保持一致的翻譯閱讀框架,2024/1/23,融合型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建,用于融合蛋白構(gòu)建的受體蛋白：谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST） 維持良好空間構(gòu)象硫氧化還原蛋白（TrxA） 維持良好空間構(gòu)象 pTrxFus泛素蛋白（Ubi） 維持良好空間構(gòu)象金黃色葡萄球菌蛋白A（SAPA） 免疫親和層析 pRIT2Tβ-半乳糖苷酶（LacZ） 免疫親和層析外膜蛋白（OmpF） 促進(jìn)分泌麥芽糖結(jié)合蛋白（M

30、BP） 促進(jìn)分泌,2024/1/23,目的蛋白的回收,融合蛋白中受體蛋白部分的存在可能會(huì)影響目的蛋白的空間構(gòu)象和生物活性，如果將之注入人體還會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng)制備和生產(chǎn)目的蛋白時(shí)，需將融合蛋白中的受體蛋白部分完整除去融合蛋白的位點(diǎn)專(zhuān)一性斷裂方法有兩種：化學(xué)斷裂法 酶促裂解法,2024/1/23,目的蛋白的回收,化學(xué)斷裂法：最佳試劑為溴化氰（CNBr），與多肽鏈中的甲硫氨酸殘基側(cè)鏈的硫醚基反應(yīng)，生成溴化亞氨內(nèi)酯，后者不穩(wěn)定，在水的作

31、用下肽鍵斷裂，形成兩個(gè)多肽降解片段，其中上游肽段的甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)化為高絲氨酸殘基，而下游肽段N端的第一位氨基酸殘基保持不變。優(yōu)點(diǎn)：回收率高 85%以上；專(zhuān)一性強(qiáng)；產(chǎn)生的目的蛋白N端不含甲硫氨酸，接近真核生物細(xì)胞中的成熟表達(dá)產(chǎn)物如果異源蛋白分子內(nèi)部含有甲硫氨酸殘基，則不能用此方法,2024/1/23,目的蛋白的回收,酶促裂解法：?jiǎn)螝埢稽c(diǎn)特點(diǎn)：斷裂效率更高每種蛋白酶均具有相應(yīng)的斷裂位點(diǎn)決定簇，因此可供選擇的專(zhuān)一性斷裂位點(diǎn)范圍較廣。

32、幾種斷裂位點(diǎn)專(zhuān)一性最強(qiáng)的商品化蛋白酶分別在多肽鏈中的精氨酸、谷氨酸、賴(lài)氨酸殘基處切開(kāi)酰胺鍵，形成不含上述殘基的下游斷裂肽段，與溴化氰化學(xué)斷裂法相似。前提條件：外源蛋白分子內(nèi)部不能含有精氨酸、谷氨酸或賴(lài)氨酸殘基，適合小分子多肽，大分子量的異源蛋白上述三種氨基酸殘基的出現(xiàn)頻率相當(dāng)高,2024/1/23,目的蛋白的回收,酶促裂解法：多殘基位點(diǎn)為克服單一氨基酸殘基酶切位點(diǎn)的局限性寡肽序列-多殘基位點(diǎn)：受體蛋白編碼序列與不含起始密碼子的外

33、源基因之間加裝一段編碼寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）的人工接頭片段，為具有蛋白酶活性的凝血因子X(jué)a的識(shí)別和作用序列，斷裂位點(diǎn)在ArgC末端純化后的融合蛋白用Xa處理，可獲得不含上述寡肽序列的目的蛋白Xa的識(shí)別作用序列由四個(gè)氨基酸殘基組成，大多數(shù)蛋白質(zhì)中出現(xiàn)這種寡肽序列的概率極少，可廣泛用于從融合蛋白中回收各種不同大小的目的蛋白產(chǎn)物,2024/1/23,寡聚型異源蛋白的表達(dá),從理論上講，外源基因的表達(dá)水平與受體細(xì)胞中可轉(zhuǎn)錄

34、基因的拷貝數(shù)（即基因劑量）呈正相關(guān)。重組質(zhì)粒含有外源基因外，還攜帶其它的可轉(zhuǎn)錄基因，如作為篩選標(biāo)記的抗生素抗性基因等。重組質(zhì)?？截悢?shù)的不斷增加，受體細(xì)胞內(nèi)的大部分能量和原料被用于合成所有的重組質(zhì)粒編碼蛋白，細(xì)胞的正常生長(zhǎng)代謝受到影響通過(guò)增加質(zhì)?？截悢?shù)提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)量并不能獲得滿意的效果。寡聚串聯(lián)型異源蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建：將多拷貝外源基因，克隆在低拷貝質(zhì)粒上，通過(guò)增加外源基因劑量而提高目標(biāo)蛋白產(chǎn)量,2024/1/23,以

35、寡聚形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn),目的蛋白高效表達(dá)不提高質(zhì)粒拷貝數(shù)的前提下，增加目的基因的拷貝數(shù)，一定程度上改善表達(dá)量穩(wěn)定表達(dá)小分子短肽短肽缺乏有效的空間結(jié)構(gòu)，在細(xì)菌細(xì)胞中的半衰期較短。串聯(lián)短肽具有與蛋白質(zhì)相似的長(zhǎng)度及空間結(jié)構(gòu)，因而抗蛋白酶降解的能力大幅度提高目的產(chǎn)物回收困難寡聚短肽需要裂解和進(jìn)一步分離，才能獲最終分子，但裂解后的短肽分子容易出現(xiàn)序列不均一性,2024/1/23,寡聚型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建,基本策略：,2024

36、/1/23,整合型異源蛋白的表達(dá),以整合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)目的基因穩(wěn)定表達(dá)整合型的目的基因隨受體細(xì)胞染色體DNA的復(fù)制而復(fù)制，在大多數(shù)情況下相當(dāng)穩(wěn)定，工程菌在沒(méi)有選擇壓力存在下可以連續(xù)培養(yǎng)而不丟失目的基因表達(dá)盒，改良物種遺傳性狀為目的目的基因表達(dá)率低單拷貝整合的目的基因表達(dá)率受到限制可通過(guò)強(qiáng)化表達(dá)元件而加以補(bǔ)償,2024/1/23,DNA體內(nèi)重組的基本原理,在生物體細(xì)胞尤其是原核細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，廣泛存在著DNA的遺傳重組機(jī)制

37、，生物學(xué)功效是促進(jìn)生物種群的進(jìn)化。細(xì)胞內(nèi)的遺傳重組可分為兩大類(lèi)：轉(zhuǎn)位因子依賴(lài)型同源序列依賴(lài)型,2024/1/23,DNA體內(nèi)重組的基本原理,轉(zhuǎn)位因子依賴(lài)型的體內(nèi)重組：轉(zhuǎn)位因子家族轉(zhuǎn)位因子--生物細(xì)胞內(nèi)天然存在的一類(lèi)無(wú)復(fù)制能力的DNA可移動(dòng)因子，不同生物種群擁有結(jié)構(gòu)不同的轉(zhuǎn)位因子噬菌體G片段（G-Fragment） 原核細(xì)菌插入順序（IS） 真核細(xì)菌轉(zhuǎn)座子（Tn、Ty） 高等植物可移動(dòng)因子（Ac、Ds） 高等動(dòng)物

38、跳躍基因（mobil gene）,2024/1/23,DNA體內(nèi)重組的基本原理,轉(zhuǎn)位因子依賴(lài)型的體內(nèi)重組：轉(zhuǎn)位因子的結(jié)構(gòu),2024/1/23,DNA體內(nèi)重組的基本原理,轉(zhuǎn)位因子依賴(lài)型的體內(nèi)重組：整合形式,2024/1/23,DNA體內(nèi)重組的基本原理,同源序列依賴(lài)型的體內(nèi)重組：基本形式原核細(xì)胞中，染色體DNA鏈上的兩個(gè)同源區(qū)之間可發(fā)生同源重組，其頻率與細(xì)菌種類(lèi)、兩個(gè)同源區(qū)之間的距離、同源區(qū)的長(zhǎng)度、同源程度密切相關(guān)。距離越遠(yuǎn)、長(zhǎng)度越長(zhǎng)

39、、同源性越高，重組的頻率也就越高，反之亦然。同源重組有整合和交換兩種形式，前者只需要一個(gè)斷裂位點(diǎn)，而后者涉及兩個(gè)斷裂位點(diǎn),2024/1/23,DNA體內(nèi)重組的基本原理,同源序列依賴(lài)型的體內(nèi)重組：同源整合,2024/1/23,DNA體內(nèi)重組的基本原理,同源序列依賴(lài)型的體內(nèi)重組：同源交換,2024/1/23,蛋白酶抗性 / 缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建,穩(wěn)定性：無(wú)論在真核生物，還是在原核細(xì)胞中，重組目的蛋白都可能被降解，其穩(wěn)定性常常不如半衰期較短

40、的內(nèi)源性蛋白質(zhì)。不穩(wěn)定性根源：對(duì)受體細(xì)胞蛋白酶系統(tǒng)的敏感性。解決：通過(guò)蛋白序列的人工設(shè)計(jì) 受體細(xì)胞的改造,2024/1/23,蛋白酶缺陷型受體細(xì)胞的改造,lon基因缺陷的大腸桿菌受體（lon -）：大多數(shù)不穩(wěn)定的重組目的蛋白被大腸桿菌中的蛋白酶La和Ti降解，分別由lon和clp基因編碼，蛋白水解活性依賴(lài)于ATPlon基因由熱休克等環(huán)境壓力激活，細(xì)胞內(nèi)異常蛋白或重組異源蛋白的過(guò)量表達(dá)也可作為一種環(huán)境壓力誘導(dǎo)lon基

41、因的表達(dá)。lon -的大腸桿菌突變株可使半衰期較短的細(xì)菌調(diào)控蛋白（如SulA、RscA、lN）穩(wěn)定性大增，被廣泛用作外源基因高效表達(dá)的受體菌,2024/1/23,蛋白酶缺陷型受體細(xì)胞的改造,htpR基因缺陷的大腸桿菌受體（htpR-）：大腸桿菌中龐大的熱休克蛋白家族：降解異?；虍愒吹鞍?，其機(jī)理是脅迫異常或異源蛋白形成一種對(duì)蛋白酶識(shí)別和降解較有利的空間構(gòu)象，提高異常或異源蛋白對(duì)蛋白酶的敏感性。熱休克基因dnaK、dnaJ、groEL

42、、grpE以及環(huán)境壓力特異性s因子編碼基因htpR的突變株均呈現(xiàn)出對(duì)異源蛋白降解作用的嚴(yán)重缺陷，特別是lon-htpR-的雙缺陷株，非常適合高效表達(dá)各種不穩(wěn)定的重組異源蛋白。,2024/1/23,抗蛋白酶的重組異源蛋白序列的設(shè)計(jì),多肽鏈C末端氨基酸序列對(duì)穩(wěn)定性的影響極性氨基酸，天門(mén)冬氨酸Asp對(duì)提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的效應(yīng)最顯著，Asp殘基離C末端越近，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性就越大在多種結(jié)構(gòu)和功能相互獨(dú)立的蛋白質(zhì)C末端引入Asp殘基，能顯著地延長(zhǎng)

43、蛋白質(zhì)的半衰期,2024/1/23,抗蛋白酶的重組異源蛋白序列的設(shè)計(jì),多肽鏈N末端氨基酸序列對(duì)穩(wěn)定性的影響：多肽鏈的N末端序列中含有較高比例的Ala、Asn、Cys、Gln、His，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性顯著改善。N末端含有Pro、Glu、Ser、Thr的真核生物蛋白質(zhì)，在真核和原核細(xì)胞中的半衰期通常很短，尤其Pro-Glu-Ser-Thr序列（PEST序列），是胞內(nèi)蛋白酶的超敏感區(qū),2024/1/23,基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對(duì)策,基

44、因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略,2024/1/23,基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制,工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)形式主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，兩種表現(xiàn)形式結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失分配不穩(wěn)定性整個(gè)重組DNA分子從受體細(xì)胞中逃逸（curing）,2024/1/23,基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制,工程菌遺傳不穩(wěn)定性的產(chǎn)生機(jī)制受體細(xì)

45、胞中的限制修飾系統(tǒng)對(duì)外源重組DNA分子的降解外源基因的高效表達(dá)嚴(yán)重干擾受體細(xì)胞正常的生長(zhǎng)代謝能量、物質(zhì)的匱乏、外源基因表達(dá)產(chǎn)物的毒性，誘導(dǎo)受體細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)：關(guān)閉合成途徑，啟動(dòng)降解程序重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)的不均勻分配重組質(zhì)粒逃逸的基本原因受體細(xì)胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進(jìn)重組分子的缺失重排,2024/1/23,基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制,重組質(zhì)粒的逃逸率宏觀逃逸率：含有重組質(zhì)粒的工程菌在非選擇性條件下生長(zhǎng)時(shí)，培養(yǎng)系

46、統(tǒng)中一部分細(xì)胞不再攜帶重組質(zhì)粒，這些空載細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)之比。重組質(zhì)粒逃逸的原因：高溫培養(yǎng)、表面活性劑（SDS）、藥物（利福平）、染料（吖啶）促使重組質(zhì)粒滲漏受體細(xì)胞中的核酸酶降解重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)不均勻分配拷貝數(shù)的差異隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增多而加劇,2024/1/23,改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略,改進(jìn)載體受體系統(tǒng)施加選擇壓力控制目的基因的過(guò)量表達(dá)優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)工藝,2024/1/23,改善基因工程菌

47、不穩(wěn)定性的策略,改進(jìn)載體受體系統(tǒng)以增大質(zhì)粒穩(wěn)定性為目的構(gòu)建載體--受體系統(tǒng)：將R1質(zhì)粒上的parB基因引入表達(dá)型載體中，其表達(dá)產(chǎn)物可以選擇性地殺死由于分配不均勻所產(chǎn)生的無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞正確設(shè)置載體上的多克隆位點(diǎn)，禁止DNA片段插在穩(wěn)定區(qū)內(nèi)將受體細(xì)胞的致死性基因安裝在載體上，同時(shí)構(gòu)建條件致死性的相應(yīng)受體系統(tǒng)，如大腸桿菌的ssb基因（DNA單鏈結(jié)合蛋白編碼基因）,2024/1/23,改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略,施加選擇壓力根據(jù)載體上的

48、抗藥性標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗生素 藥物和食品生產(chǎn)時(shí)禁止使用抗生素根據(jù)載體上的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)組份 培養(yǎng)基復(fù)雜，成本較高,2024/1/23,改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略,控制目的基因的過(guò)量表達(dá)使用可控型啟動(dòng)子控制目的基因的定時(shí)表達(dá)及表達(dá)程度使用可控型復(fù)制子控制質(zhì)粒的定時(shí)增殖或降低質(zhì)粒的拷貝數(shù)優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)工藝培養(yǎng)基組成：限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定培養(yǎng)溫度： 較