大腸桿菌基因工程菌轉化半纖維素水解液生產木糖醇的研究.pdf

1、木糖醇是一種五碳糖醇，具有抗齲齒、代謝不依賴胰島素、改善肝功能等特點，廣泛應用于食品、醫(yī)藥和化工等行業(yè)。當前工業(yè)上生產木糖醇主要是利用半纖維素水解液中分離純化獲得的純木糖，在高溫高壓條件下使用鎳催化加氫制得，這種工藝條件苛刻、容易造成污染、生產成本較高。生物法生產木糖醇不需要高溫高壓條件、污染環(huán)境的鎳和高純度木糖等，所以生物法生產木糖醇越來越受到人們的重視。大腸桿菌作為生產各種高附加值化學品的理想宿主，其具有培養(yǎng)條件簡單、能夠利用半纖維

2、素水解液中所有糖類、生長速度快、基因操作簡便、蛋白表達水平高等諸多優(yōu)點。目前，以大腸桿菌為宿主利用半纖維素水解液生產木糖醇的研究已有報道，但其生產效率低且成本較高，和化學法相比還不具備優(yōu)勢。本論文以大腸桿菌W3110為宿主細胞，針對目前基因工程菌生產木糖醇存在的問題，主要圍繞以下四個方面進行了研究:1）在較高溫度下蛋白的高效可溶表達;2）目的基因在宿主菌中遺傳穩(wěn)定性;3）生產過程中副產物阿拉伯糖醇的消除;4）工業(yè)應用中培養(yǎng)基的廉價化。<

3、br>　　首先，為了解決在較高溫度下蛋白可溶表達問題，我們基于質粒載體系統(tǒng)構建了第一代高產木糖醇菌株。利用質粒載體進行蛋白的表達，通過mRNA二級結構的調節(jié)，構建了一個能在較高溫度下高效可溶表達的質粒;在30℃條件下，酶活是出發(fā)菌株的5.68倍。通過敲除葡萄糖磷酸轉移酶系統(tǒng)中酶Ⅱ組分的ptsG基因，消除菌株的代謝物阻遏效應，使菌株能同時轉運葡萄糖和木糖;敲除菌株自身代謝木糖的基因xylA和xylB，阻斷木糖的代謝利用;敲除可轉運木糖醇的

4、果糖磷酸轉移酶系統(tǒng)中酶Ⅱ組分的ptsF基因，減少木糖醇的磷酸化;通過一系列的優(yōu)化，木糖醇生產效率是出發(fā)菌株的8.71倍。在實驗室小試中，工程菌利用純木糖進行補料分批發(fā)酵，產生了172.4 g/L的木糖醇，生產效率為1.57 gL-1h-1，相對于葡萄糖的摩爾得率達到2.2;利用半纖維素水解液生產木糖醇時，產物濃度和生產效率分別達到150gL-1和1.40 g L-1 h-1。
　　接著，為了解決使用質粒系統(tǒng)帶來的菌株遺傳不穩(wěn)定的問

5、題，我們建立了一套基因組多拷貝整合系統(tǒng)RecA-assisted chromosomal integration(RACI)，使xr基因以特定拷貝數整合進大腸桿菌的基因組;整個整合系統(tǒng)的核心是構建一個含有IS5序列、R6K復制子、P43啟動子和xr基因的載體;利用IS5序列作為整合位點進行大腸桿菌基因組多拷貝整合，目的基因能在菌株內穩(wěn)定遺傳。利用該系統(tǒng)，我們構建了一株基因組中存在4個拷貝xr的菌株。工程菌利用純木糖進行分批發(fā)酵時，產生了

6、110.1 g L-1木糖醇，生產效率為3.06 g L-1 h-1，此生產效率和使用多拷貝質粒菌株的生產效率大致相當，但其優(yōu)點是不需要額外添加抗生素和誘導劑，降低了生產成本。
　　進一步，為了解決木糖醇生產過程中副產物阿拉伯糖醇的問題，我們對木糖還原酶進行了定點突變，提高其對木糖的選擇性，獲得了一個對阿拉伯糖活性降低了27倍的突變體。在搖瓶發(fā)酵中，含有此突變體的菌株在使用質粒作為表達載體時，在產物中已檢測不到阿拉伯糖醇的存在;但

7、在發(fā)酵罐發(fā)酵中仍有47.34％的阿拉伯糖轉化成阿拉伯糖醇。我們發(fā)現(xiàn)使用整合型菌株（木糖還原酶酶活較低），可以顯著降低阿拉伯糖醇的產生，只有9.6％的阿拉伯糖轉化成阿拉伯糖醇。使用含有突變酶的整合型菌株在發(fā)酵罐中轉化半纖維素水解液生產木糖醇時，在產物中已檢測不到阿拉伯糖醇。
　　最后，為了使本工藝實現(xiàn)產業(yè)化，獲得符合產業(yè)化需要的培養(yǎng)基組成，我們選擇工業(yè)級玉米漿干粉作為氮源，工業(yè)級葡萄糖作為碳源，半纖維素水解液作為底物，對生產條件進行

8、了優(yōu)化?？疾炝藴囟葘γ富詈湍咎谴忌a效率的影響，確定了菌株在30℃條件下，木糖醇的生產效率最高;經過搖瓶水平的發(fā)酵條件優(yōu)化，確定了最佳底物濃度為20 g L-1，最佳底物添加時機為菌株培養(yǎng)4小時后添加。進行補料分批發(fā)酵時，工程茵產生了143.8g L-1的木糖醇，生產效率為1.84g L-1 h-1。
　　總之，通過本論文的系統(tǒng)研究，實現(xiàn)了重組大腸桿菌利用廉價培養(yǎng)基轉化半纖維素水解液生產高純度木糖醇，為木糖醇的工業(yè)化生產奠定了堅實