產(chǎn)D-阿拉伯糖醇酵母菌株的篩選、發(fā)酵與產(chǎn)木糖醇基因工程菌的構(gòu)建.pdf

1、木糖醇，一種重要的功能性糖醇，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化工領(lǐng)域，具有重要的應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)潛力。目前國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)木糖醇的方法有三種:直接提取法、化學(xué)合成法和生物轉(zhuǎn)化法。本文以最具競(jìng)爭(zhēng)力的全生物法綠色路線為研究背景，主要探討其兩步關(guān)鍵生物轉(zhuǎn)化步驟。第一步，發(fā)酵D-葡萄糖合成D-阿拉伯糖醇;第二步，構(gòu)建D-阿拉伯糖醇到木糖醇的基因工程菌。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　(1)利用高糖富集培養(yǎng)技術(shù)，從天然高糖環(huán)境——蜂巢和蜂蜜中篩選到260株耐高糖酵

2、母。隨后，對(duì)這些菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵初篩試驗(yàn)，并且對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)液中的多元醇種類進(jìn)行了初步鑒定分析，得到92株能夠產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的酵母菌株。確立了一種簡(jiǎn)單有效分離底物葡萄糖和多元醇類產(chǎn)物的層析方法，即以微晶纖維素板為展開(kāi)介質(zhì)，定性檢測(cè)的展開(kāi)劑及其配比為:乙酸乙酯∶吡啶∶冰醋酸∶水=16∶10∶2∶3。通過(guò)搖瓶復(fù)篩，最終得到一株高產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的目標(biāo)菌株，根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)和ITSrDNA序列的測(cè)定分析，該目標(biāo)菌株鑒定為Zygosa

3、ccharomyces rouxii，命名為Zygosaccharomyces rouxii JM-C46，該菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為:CCTCC M2014205。
　　(2)對(duì)菌株Z.rouxii JM-C46進(jìn)行了產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的搖瓶發(fā)酵優(yōu)化，結(jié)果表明Z.rouxii JM-C46的最優(yōu)初始葡萄糖糖度為:200 g/L;最優(yōu)發(fā)酵條件為pH5.0、溫度30℃、220 rpm、接種量5％(v/v)、裝液量1

4、00 mL（500 mL搖瓶）。采用最適發(fā)酵條件對(duì)菌株Z.rouxii JM-C46進(jìn)行搖瓶發(fā)酵96 h，D-阿拉伯糖醇的產(chǎn)量從優(yōu)化前的71.19 g/L提升到76.08±0.49 g/L。利用Z.rouxii JM-C46菌株轉(zhuǎn)化底物D-葡萄糖生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇，工藝簡(jiǎn)單，安全環(huán)保，其轉(zhuǎn)化率可達(dá)38.3％，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，Z.rouxii JM-C46是一株優(yōu)良的產(chǎn)D-阿拉伯糖醇酵母菌株。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)D-阿拉

5、伯糖醇提供了參考。
　　(3)采用PCR和重疊PCR技術(shù)從G.oxydans621H中分別擴(kuò)增出木糖醇脫氫酶(XDH)和D-阿拉伯糖脫氫酶（ArDH）的編碼基因xdh和ardh;利用穿梭質(zhì)粒pYES2，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pYES2-xdh、pYES2-ardh和協(xié)同表達(dá)質(zhì)粒pYES2-xdh-ardh。SDS-PAGE電泳分析結(jié)果顯示，重組菌中的目的蛋白得到了表達(dá)，分別有28 kDa和27 kDa特征條帶出現(xiàn)，但在E.coli宿主

6、菌中表達(dá)量很少。
　　(4)將重組質(zhì)粒pYES2-xdh、pYES2-ardh和pYES2-xdh-ardh分別導(dǎo)入Saccharomyces cerevisiae INVSc1中，經(jīng)半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果顯示:重組菌S.cerevisiae INVSc1-pYES2-xdh和S.cerevisiae-pYES2-ardh中的重組蛋白XDH和ArDH在真核表達(dá)系統(tǒng)中均得到了高效表達(dá)，大小分別為28 kDa和27

7、 kDa;重組菌S.cerevisiaeINVSc1-pYES2-xdh-ardh的電泳圖譜出現(xiàn)了兩條特異性蛋白條帶，大小分別為28 kDa和27 kDa，表明XDH和ArDH基因在真核表達(dá)系統(tǒng)中均獲得了高效表達(dá)，即實(shí)現(xiàn)了共表達(dá)。
　　(5)將重組菌S.cerevisiae INVSc1-pYES2-xdh-ardh進(jìn)行D-阿拉伯糖醇搖瓶(500ml-1L)發(fā)酵試驗(yàn):以含D-阿拉伯糖醇的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵時(shí)得到木糖醇產(chǎn)量為23.7 g