基于楊木發(fā)酵產(chǎn)丁醇糖丁酸梭菌工程菌的構(gòu)建.pdf

1、隨著全球經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，能源消耗量與日俱增。在目前的能源結(jié)構(gòu)中，80％的能源消耗來自化石能源，這不僅使化石能源趨近枯竭，而且也帶來了環(huán)境的惡化。因此，尋求可替代的綠色環(huán)保能源成為國(guó)家能源開發(fā)的重點(diǎn)。在眾多的綠色能源中，相比于天然氣、氫能源和合成氣，生物能源是最好的環(huán)境友好型能源。而生物丁醇作為新生代可再生能源，具有更高的燃燒值和辛烷值，且能夠直接用于未加改造的機(jī)動(dòng)引擎。
　　糖丁酸梭菌BAA-117作為丁醇生產(chǎn)的主要菌株，能夠利用楊木

2、水解液發(fā)酵產(chǎn)丁醇(7.51g/L)。但是由于楊木水解液中含有酸性及酚類物質(zhì)等抑制物，目標(biāo)菌的丁醇產(chǎn)量一直不高。6-磷酸果糖激酶(PFK)和丙酮酸激酶(PYK)作為丁醇代謝的上游階段關(guān)鍵酶，為丁醇的合成提供還原力NADH。因此，本實(shí)驗(yàn)希望通過異源表達(dá)pfkA和pyk基因來提高丁醇的產(chǎn)量。
　　本實(shí)驗(yàn)以乳酸球菌總DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增得到了6-磷酸果糖激酶基因（pfkA）、丙酮酸激酶基因(pyk)和pfkA-pyk，然后分別連

3、接到pMD18-T載體上，構(gòu)建T-pfkA、T-pyk克隆載體，提取重組T載體，待重組T載體和pfkA-pyk基因片段測(cè)序驗(yàn)證無誤后，通過BamH、AvaI雙酶切T載體片段和雙基因片段，連接到表達(dá)載體pSOS94上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSOS94-pfkA、pSOS94-pyk和pSOS94-pfkA-pyk。然后，將重組質(zhì)粒pSOS94-pfkA、pSOS94-pyk和pSOS94-pfkA-pyk轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli R2275（含

4、有質(zhì)粒pAN1）中以獲得甲基化，提取經(jīng)過甲基化的表達(dá)載體pSO S94-pfkA、pSOS94-pyk和pSOS94-pfkA-pyk，電轉(zhuǎn)化糖丁酸梭菌BAA-117，成功構(gòu)建出糖丁酸梭菌工程菌3株—糖丁酸梭菌BAA-117（pSOS94-pfkA）、糖丁酸梭菌BAA-117(pSOS94-pyk)、糖丁酸梭菌BAA-117（pSOS94-pfkA-pyk)。
　　工程菌在含有50μg/L的紅霉素誘導(dǎo)下進(jìn)行楊木發(fā)酵產(chǎn)丁醇試驗(yàn)，收集

5、菌液，進(jìn)行一系列細(xì)胞破碎處理，然后進(jìn)行SDS蛋白凝膠電泳與ABE產(chǎn)量氣相色譜分析。蛋白凝膠電泳結(jié)果顯示，3株工程菌株都表達(dá)了相應(yīng)的外源基因。工程菌糖丁酸梭菌BAA-117(pSOS94-pfkA)、糖丁酸梭菌BAA-117(pSOS94-pyk)和糖丁酸梭菌BAA-117（pSOS94-pfkA-pyk）丁醇發(fā)酵產(chǎn)量分別為7.68g/L、8.13g/L、8.72 g/L，比原始菌株分別提高4％、10％和18％，而丙酮產(chǎn)量相對(duì)下降，乙醇產(chǎn)