拜氏梭菌改良及丁醇發(fā)酵條件研究.pdf

1、近年來，隨著化石燃料儲(chǔ)備量的日益減少及其過度使用帶來的環(huán)境污染日趨嚴(yán)峻，各國科研人員極力尋找可再生的清潔能源。丁醇具有燃燒值高、腐蝕性小、可與汽油任意比混合等優(yōu)點(diǎn)，得到研究人員的廣泛青睞，被認(rèn)為是潛在的新型能源。發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇因具有反應(yīng)溫和、選擇性好、不需要添加催化劑等優(yōu)點(diǎn)而倍受關(guān)注，但也面臨著原料成本高、產(chǎn)物濃度低、分離純化成本高等問題。本文以拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii NCIMB8052）為出發(fā)菌株，

2、通過利用II型內(nèi)含子基因失活技術(shù)構(gòu)建基因Cbei_2073敲除載體轉(zhuǎn)化拜氏梭菌的方法，篩選出高產(chǎn)丁醇的菌株，并進(jìn)行代謝調(diào)控研究；最后，利用廉價(jià)黃姜糖液代替葡萄糖發(fā)酵丁醇來降低成本，并通過對(duì)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化來提高丁醇產(chǎn)量。主要研究結(jié)果如下：
　?。?）對(duì)Clostridium beijerinckii NCIMB8052組氨酸激酶進(jìn)行分類、篩選，并與已報(bào)道的丙酮丁醇梭菌（ Clostridium acetobutylicum A

3、TCC824）組氨酸激酶基因cac3319同源率比較，其中基因Cbei_2073與cac3319同源率最高，達(dá)到了48.54％，而其他組氨酸激酶同源率低于20%。根據(jù)II型內(nèi)含子基因敲除的方法，利用大腸桿菌-拜氏梭菌穿梭載體pMTL007C-E2成功構(gòu)建基因Cbei_2073敲除載體，并電轉(zhuǎn)化拜氏梭菌，篩選出一株紅霉素抗性菌株cb2073。通過發(fā)酵對(duì)比野生型菌株，發(fā)現(xiàn)菌株cb2073發(fā)酵性能明顯高于野生型菌株，丁醇和總?cè)軇ǘ〈肌⒈?/p>

4、乙醇）產(chǎn)量分別為12.47±0.54 g/L和18.46±0.71 g/L，分別提高了17.3%和19.5%。
　?。?）為了進(jìn)一步提高菌株cb2073的丁醇產(chǎn)量，研究了添加碳酸鈣（pH緩沖劑）、L-半胱氨酸（還原劑）、丁酸鈉（有機(jī)酸鹽）、中性紅（電子載體）和變溫發(fā)酵五種調(diào)控方式對(duì)菌株丁醇產(chǎn)量的影響。結(jié)果如下：碳酸鈣促進(jìn)了有機(jī)酸的積累，對(duì)丁醇和總?cè)軇┑暮铣捎休^強(qiáng)的抑制作用；L-半胱氨酸在低濃度時(shí)，對(duì)丁醇和總?cè)軇┑暮铣蓻]有明顯的促進(jìn)

5、作用，而隨著L-半胱氨酸濃度的增加，菌株丁醇和總?cè)軇┑暮铣梢种圃鰪?qiáng)；丁酸鈉在菌株生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期后期（16h）添加時(shí)有利于丁醇和總?cè)軇┑暮铣?，添加丁酸鈉濃度達(dá)0.3%時(shí)效果最佳，丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量相對(duì)于對(duì)照組分別提高了12.9%和8.9%；中性紅對(duì)菌株生長(zhǎng)和丁醇合成有抑制作用；變溫發(fā)酵時(shí)，對(duì)數(shù)后期（18h）降低發(fā)酵溫度繼續(xù)發(fā)酵有利于丁醇和總?cè)軇┑姆e累，降低至28℃進(jìn)行發(fā)酵時(shí)丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量最高，相比于對(duì)照組分別提高了15.5%和11.6%。

6、r>　?。?）利用黃姜糖液代替葡萄糖作為碳源發(fā)酵生產(chǎn)丁醇，發(fā)現(xiàn)黃姜糖液能夠促進(jìn)菌株cb2073丁醇和總?cè)軇┑暮铣?，相?duì)于葡萄糖發(fā)酵分別提高了8.8%和15.4%。進(jìn)一步通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化黃姜糖液培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，確定在P2培養(yǎng)基②緩沖液、③維生素和④礦物質(zhì)成分不變的情況下，初始糖濃度為70.00 g/L，酵母粉濃度為0.55 g/L，初始pH6.0，轉(zhuǎn)速150 rpm，34℃發(fā)酵至18 h，添加4.92 g/L的丁酸鈉，同時(shí)將