丙酮丁醇梭菌的改造、發(fā)酵以及產(chǎn)物分離.pdf

1、生物丁醇作為新一代的生物能源，具有熱值高，能與汽油混溶等優(yōu)良性能，受到越來越多的關(guān)注。利用可再生原料生產(chǎn)生物丁醇是目前的一種趨勢，而菊芋因為耐旱耐鹽堿等優(yōu)點，成為一種非常有潛力的原料。菊芋塊莖水解液的主要成分是果糖和葡萄糖（~4:1）。Clostridium acetobutylicum L7在進(jìn)行ABE發(fā)酵過程中不能有效利用果糖，而且在混合糖發(fā)酵體系中存在糖阻遏效應(yīng)抑制發(fā)酵的順利進(jìn)行，導(dǎo)致丁醇產(chǎn)量低。因此，本研究著眼于果糖PTS系統(tǒng)（

2、PTSFru），通過基因工程策略提高菌體對果糖、混合糖以及實際物料的利用，使得丁醇產(chǎn)量增加。而在丁醇發(fā)酵中，丁醇體積一般不會超過發(fā)酵液體積的2%，故需要有效的分離手段分離丁醇。本實驗通過滲透汽化對發(fā)酵液中丁醇進(jìn)行分離。
　　基因cac0231（fruR）、cac0232（fruB）屬于PTSFru的編碼基因，在果糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中起重要作用，其中cac0231是糖代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，cac0232編碼果糖-1-磷酸激酶。利用TargeT

3、ron基因敲除技術(shù)對這2個基因進(jìn)行敲除，得到敲除菌株C. acetobutylicum L7-Δ0231~Δ0232。對這2株菌株分別進(jìn)行以葡萄糖或果糖為唯一碳源的ABE發(fā)酵。結(jié)果表明敲除菌株對果糖的利用率均下降，其中L7-Δ0231利用16.18 g/L果糖產(chǎn)生0.56 g/L的丁醇，L7-Δ0232利用10.63 g/L果糖而不產(chǎn)生丁醇；而在利用葡萄糖時與 L7差異較小，L7-Δ0231消耗50.11 g/L葡萄糖產(chǎn)生10.56 g

4、/L丁醇，L7-Δ0232利用了葡萄糖52.23 g/L產(chǎn)生丁醇10.19 g/L。
　　對基因cac0231，cac0232進(jìn)行過表達(dá)得到過表達(dá)菌株C. acetobutylicum L7-0231~0232。對過表達(dá)菌株進(jìn)行葡萄糖、果糖為單一碳源的發(fā)酵實驗以及果糖：葡萄糖（4:1）為混合碳源的發(fā)酵實驗，最后進(jìn)行菊芋水解液發(fā)酵。當(dāng)以葡萄糖為底物進(jìn)行ABE發(fā)酵時，過表達(dá)菌株的丁醇產(chǎn)量與空載菌株沒有明顯差異，其中L7-0231利用5

5、9.87 g/L葡萄糖產(chǎn)生11.77 g/L丁醇，L7-0232消耗59.86 g/L葡萄糖產(chǎn)生11.63 g/L丁醇；而以果糖為底物的情況下過表達(dá)菌株丁醇產(chǎn)量比空載菌株有所提高，其中，L7-0231利用51.04 g/L的果糖，產(chǎn)生7.46 g/L丁醇，與空載菌株相比，果糖利用率提高119.85%，丁醇產(chǎn)量提高121.36%；L7-0232消耗了48.58 g/L的果糖，產(chǎn)丁醇7.64 g/L，相比空載菌株，果糖利用率提高109.13

6、%，丁醇產(chǎn)量提高126.73%。當(dāng)以混合糖為底物時，菌株L7-0231僅產(chǎn)生5.69 g/L丁醇，發(fā)酵性能與空載菌株接近；而菌株L7-0232能產(chǎn)生10.34 g/L的丁醇，相對于空載提高83.83%；在以菊芋水解液發(fā)酵體系中，L7-0231的發(fā)酵性能相比空載菌株無提高；而L7-0232能產(chǎn)生8.32 g/L的丁醇，與空載相比提高55.51%。
　　由于最終發(fā)酵液中丁醇濃度較低，需要通過合適的分離手段將丁醇從發(fā)酵液中分離出。滲透汽

7、化則是一種較好的分離方式，具有高效、環(huán)保等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于各類化工產(chǎn)品的分離。將過表達(dá)菌株C. acetobutylicum L7-0232以混合糖為底物的發(fā)酵液以及過表達(dá)菌株C. acetobutylicum L7-0231~0232以菊芋水解液為底物的發(fā)酵液進(jìn)行丁醇的滲透汽化分離，得到分離產(chǎn)物中的平均丁醇濃度分別為241.91 g/L，111.58 g/L，191.72 g/L，丁醇在ABE中的比例也分別提高至63.30%，68.9