產(chǎn)4-羥基異亮氨酸工程菌的構(gòu)建.pdf

1、作為一味傳統(tǒng)中藥材，葫蘆巴種子是抗糖尿病的良藥，而它的主要有效成分是一種非蛋白氨基酸:4-羥基異亮氨酸(4-hydroxy isoleucine，4-HIL)，其絕對(duì)構(gòu)型為2S，3R，4S。目前主要采用化學(xué)萃取法制備4-HIL，但由于收率較低、原料成本高、工藝復(fù)雜等問(wèn)題難以工業(yè)化生產(chǎn)。
　　2009年，Kodera等人在蘇云金芽胞桿菌中發(fā)現(xiàn)了L-異亮氨酸雙加氧酶(L-isoleucine dioxygenase，IDO)。它是一種

2、新型α-酮戊二酸依賴(lài)型雙加氧酶。在α-酮戊二酸、亞鐵離子和抗壞血酸存在的條件下，IDO可催化如下反應(yīng): L-Ile+αKG+O2 IDO→4-HIL+Succinic acid+CO2。
　　由于IDO基因最初發(fā)現(xiàn)自蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt），本研究首先對(duì)IDO基因在Bt菌株中的分布進(jìn)行探究。PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)選取的29種不同血清型的Bt菌株中有24株含有IDO基因，表明IDO基因在Bt菌株中

3、是廣泛分布的。
　　本研究以蘇云金芽胞桿菌Bt75為模板，成功擴(kuò)增出IDO基因片段，并在大腸桿菌BL21中表達(dá)了重組IDO蛋白。利用高壓液相色譜法(HPLC)測(cè)得重組IDO蛋白酶活為1.09μmol/min/mg，1h后L-Ile的轉(zhuǎn)化率為70.9％。酶學(xué)性質(zhì)研究表明，Cu2+與Zn2+對(duì)酶活的抑制作用非常顯著，而EDTA對(duì)酶活的抑制作用最強(qiáng)。
　　IDO的最適反應(yīng)溫度25℃，在20℃～30℃之間，酶活均高于80％。但是當(dāng)溫