L-異亮氨酸生產(chǎn)菌株的構(gòu)建及發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf

1、L-異亮氨酸是八種必需氨基酸之一，在人體代謝中具有重要作用。在L-異亮氨酸的合成過程中，乙酰羥基酸合成酶催化丙酮酸和前體α-酮基丁酸生成L-異亮氨酸。由于乙酰羥基酸合成酶對α-酮基丁酸親和性高于丙酮酸，當(dāng)胞內(nèi)α-酮基丁酸供應(yīng)量增加時，乙酰羥基酸合成酶可優(yōu)先催化生成L-異亮氨酸。同時乙酰羥基酸合成酶是L-異亮氨酸合成途徑的限速酶，強化該酶可以加速限速反應(yīng)，有利于L-異亮氨酸積累。
　　為了研究增加胞內(nèi)α-酮基丁酸的供應(yīng)和強化乙酰羥基

2、酸合成酶對L-異亮氨酸發(fā)酵的影響，本文以L-異亮氨酸生產(chǎn)菌C.glutamicum YILW為出發(fā)菌株進(jìn)行改造，通過質(zhì)粒過表達(dá)cimA成功構(gòu)建了C.glutamicum YILWpXMJ19cimA;在出發(fā)菌株基因組ilvB上游插入Ptac強啟動子成功構(gòu)建C.glutamicum YILWPtac;在C.glutamicumYILWPtac基礎(chǔ)上質(zhì)粒過表達(dá)cimA，獲得C.glutamicum YILWPtacpXMJ19cimA。通過

3、RT-PCR分析，cimA和ilvB的轉(zhuǎn)錄量分別提高了920.0倍和12.5倍。SDS-PAGE分析cimA在C.glutamicum YILWpXMJ19cimA可以表達(dá)。
　　對出發(fā)菌株和改造菌進(jìn)行搖瓶補料分批發(fā)酵比較改造菌產(chǎn)酸水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與出發(fā)菌C.glutamicum YILW相比，YILWpXMJ19cimA和YILWPtac的L-異亮氨酸積累量提高了8.9％和14.8％，糖酸轉(zhuǎn)化率提高了17.8％和18.6％

4、，單位菌體產(chǎn)酸提高了15.1％和20.3％，副產(chǎn)物L(fēng)-丙氨酸較原菌分別降低了25.0％和29.9％。C.glutamicum YILWPtacpXMJ19cimA的L-異亮氨酸積累量較原菌提高了14.5％，副產(chǎn)物L(fēng)-丙氨酸較原菌降低了8.6％，糖酸轉(zhuǎn)化率和單位菌體產(chǎn)酸分別提高了42.4％和17.6％，糖酸轉(zhuǎn)化率較YILWpXMJ19cimA和YILWPtac分別提高了20.8％和20.0％。實驗結(jié)果表明通過Ptac強啟動子插入?yún)f(xié)同cim

5、A表達(dá)增加胞內(nèi)α-酮丁酸的供應(yīng)和強化限速酶乙酰羥基酸合成酶的方法可以提高產(chǎn)酸，并能夠較明顯的提高菌體的糖酸轉(zhuǎn)化率。代謝分析表明L-異亮氨酸合成代謝流從1.09％分別提高到2.33％、7.69％和4.26％。
　　5L發(fā)酵罐發(fā)酵實驗出現(xiàn)菌體在20 h過早地進(jìn)入穩(wěn)定期，并表現(xiàn)出生長停滯，耗糖耗氧變慢的情況。針對該現(xiàn)象在發(fā)酵過程中依次流加了豆餅水解液、玉米漿、生物素、氨基酸復(fù)合液、嘌呤核苷、酵母粉及微量元素等多種營養(yǎng)物質(zhì)。結(jié)果菌體生物量