糖化酵母工程菌構(gòu)建及其表達酶和產(chǎn)乙醇研究.pdf

1、由于對石油的過度依賴,能源危機和環(huán)境污染已成為制約各國經(jīng)濟發(fā)展,影響人類健康的主要因素。開發(fā)新能源已成為一項迫切的任務。生物乙醇是一種綠色的可再生能源,主要由纖維素質(zhì)與淀粉質(zhì)發(fā)酵獲得,具有巨大生產(chǎn)潛能。
　　 淀粉質(zhì)轉(zhuǎn)化乙醇早已進入商業(yè)規(guī)模,我國已形成相關產(chǎn)業(yè)鏈。分解支鏈淀粉的異淀粉酶和水解淀粉生成葡萄糖的糖化酶或α-淀粉酶是淀粉釀酒過程中必須添加的酶。P.Pastoris是良好的外源基因表達宿主。本項目研究用P.pastori

2、s表達α淀粉酶和異淀粉酶。通過PCR法擴增達α淀粉酶基因(α-amy)和異淀粉酶基因(iso),并使其基因的3'末端融合了His標簽。構(gòu)建P.pastoris表達載體(pGAP9K-α-amy和pGAP9K-iso).利用電轉(zhuǎn)化技術將重組表達載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,經(jīng)500-1,000μg/mL的G418抗生素篩選得到陽性菌株GS115(pGAP9K-α-amy)和GS115(pGAP9K-iso),將搖瓶表達產(chǎn)物進行分解淀粉和支鏈

3、淀粉試驗,篩選高表達重組子作為工程菌。在生物反應器中高密度發(fā)酵工程菌株GS115(pGAP9K-α-amu)56h時,生物量A600為186,表達α-AMY產(chǎn)量最高約為125mg/L,表達產(chǎn)物具有水解淀粉活性,活力為68.32U/ml。
　　 之所以在釀酒過程中需添加糖化淀粉的酶類是因為釀酒酵母缺乏這些酶。這些酶的生產(chǎn)增加了淀粉質(zhì)原料乙醇的成本。
　　 本課題應用DNA操作將異淀粉酶和糖化酶基因重組于京龍一號釀酒酵母。通