糖化酵母工程菌構(gòu)建及其表達(dá)酶和產(chǎn)乙醇研究.pdf

1、由于對(duì)石油的過度依賴,能源危機(jī)和環(huán)境污染已成為制約各國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展,影響人類健康的主要因素。開發(fā)新能源已成為一項(xiàng)迫切的任務(wù)。生物乙醇是一種綠色的可再生能源,主要由纖維素質(zhì)與淀粉質(zhì)發(fā)酵獲得,具有巨大生產(chǎn)潛能。
　　 淀粉質(zhì)轉(zhuǎn)化乙醇早已進(jìn)入商業(yè)規(guī)模,我國(guó)已形成相關(guān)產(chǎn)業(yè)鏈。分解支鏈淀粉的異淀粉酶和水解淀粉生成葡萄糖的糖化酶或α-淀粉酶是淀粉釀酒過程中必須添加的酶。P.Pastoris是良好的外源基因表達(dá)宿主。本項(xiàng)目研究用P.pastori

2、s表達(dá)α淀粉酶和異淀粉酶。通過PCR法擴(kuò)增達(dá)α淀粉酶基因(α-amy)和異淀粉酶基因(iso),并使其基因的3'末端融合了His標(biāo)簽。構(gòu)建P.pastoris表達(dá)載體(pGAP9K-α-amy和pGAP9K-iso).利用電轉(zhuǎn)化技術(shù)將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,經(jīng)500-1,000μg/mL的G418抗生素篩選得到陽性菌株GS115(pGAP9K-α-amy)和GS115(pGAP9K-iso),將搖瓶表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分解淀粉和支鏈

3、淀粉試驗(yàn),篩選高表達(dá)重組子作為工程菌。在生物反應(yīng)器中高密度發(fā)酵工程菌株GS115(pGAP9K-α-amu)56h時(shí),生物量A600為186,表達(dá)α-AMY產(chǎn)量最高約為125mg/L,表達(dá)產(chǎn)物具有水解淀粉活性,活力為68.32U/ml。
　　 之所以在釀酒過程中需添加糖化淀粉的酶類是因?yàn)獒劸平湍溉狈@些酶。這些酶的生產(chǎn)增加了淀粉質(zhì)原料乙醇的成本。
　　 本課題應(yīng)用DNA操作將異淀粉酶和糖化酶基因重組于京龍一號(hào)釀酒酵母。通