不同表型的酵母工程菌對植酸酶表達的影響.pdf

1、植酸酶是一類催化植酸及植酸鹽水解成肌醇和無機磷酸的酶，添加于食品和飼料中，可以提高磷的吸收利用率，提高食品和飼料的營養(yǎng)價值；減少植酸對微量元素的螯合，消除植酸所引起的抗營養(yǎng)作用；同時也減少了動物糞便中植酸磷的含量，降低了磷對環(huán)境的污染，有利于保護環(huán)境等。因此，植酸酶的研究與應(yīng)用具有重大的理論和現(xiàn)實意義。 目前國內(nèi)外對植酸酶及其基因進行了大量研究，構(gòu)建了表型為甲醇利用型和非甲醇利用型的酵母工程菌表達植酸酶。本實驗室已構(gòu)建了一株表

2、型為甲醇利用型的菌株，研究發(fā)現(xiàn)，重組植酸酶的表達量以及酶學(xué)性質(zhì)與出發(fā)菌表達的植酸酶相比具有較大的變化，特別是pH的適用范圍得到了較大的拓寬。試驗通過原生質(zhì)體法把外源表達載體轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中，然后外源表達載體雙交換整合到畢赤酵母染色體上，獲得表型為非甲醇利用型的酵母工程菌來表達植酸酶，從而研究兩種表型的酵母工程菌對植酸酶表達的影響，為進一步研究影響植酸酶基因在畢赤酵母中表達的因素奠定理論基礎(chǔ)；也為植酸酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供更為優(yōu)良的菌株奠定基

3、礎(chǔ)。因此試驗在實驗室前期研究的基礎(chǔ)上，做了如下研究： 1．質(zhì)粒DNA的提取及線性化用質(zhì)粒少量制備試劑盒提取pPIC9K-phyA質(zhì)粒DNA，用Dra I酶酶切pPIC9K-phyA質(zhì)粒，電泳檢測表明已徹底酶切后，用酚/氯仿抽提，無水乙醇進行沉淀回收，并用10μL TE溶解，經(jīng)紫外分光法檢測DNA濃度達500ng/μL。 2．畢赤酵母(GS115)原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化用Zymolyase在高滲緩沖液中處理酵母細胞制備原

4、生質(zhì)體，在PEG和CaCl<,2>存在下與外源DNA溫育，將外源DNA導(dǎo)入原生質(zhì)體，再經(jīng)高滲選擇性培養(yǎng)基進行再生培養(yǎng)，在培養(yǎng)24小時后，平板上出現(xiàn)較多的小菌落，表明利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化也可獲得較多轉(zhuǎn)化子。 3．轉(zhuǎn)化子的表型篩選和PCR鑒定于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的細胞，直至長為大小適中的單菌落，在MM和MD平板上進行表型篩選。在MD平板上生長正常而在MM平板上生長緩慢的初步鑒定為Mut<'S>型。提取初步鑒定為Mut<'S

5、>型轉(zhuǎn)化子的總DNA，用5’AOXI引物和3’AOXl引物進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物電泳出現(xiàn)一條約1.8kb的目的帶，表明此轉(zhuǎn)化子為Mut<'S>型，共獲得21個Mut<'S>型重組子。 4．Mut<'S>重組子和Mut<'+>重組子表達植酸酶的量以及酶學(xué)性質(zhì)比較。 (1)Mut<'+>重組子在誘導(dǎo)培養(yǎng)168小時之內(nèi)，植酸酶的表達量隨時間的延長而增加，到168小時接近高峰，最高酶活達到143958.3U/mL；Mut

6、<'S>重組子在誘導(dǎo)培養(yǎng)192小時之內(nèi)植酸酶的表達量隨時間的延長而增加，到192小時接近高峰，最高酶活達到141058.3U/mL。兩種表型工程菌株表達產(chǎn)物的分子量都介于70kDa～97kDa之間。 (2) 最適pH研究結(jié)果表明，兩種重組酵母表達的植酸酶最適作用pH值都有兩個(37℃條件下反應(yīng)1小時)，分別為2.5～3.0和5.0～5.5，pH2.5與pH3.0峰值相當，pH5.0與pH5.5峰值相當，在pH4.5～6.5之間均有相當高