大腸桿菌黏附素Etp A酵母工程菌對(duì)腸道菌群和黏膜免疫的影響.pdf

1、產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）屬于致病性大腸桿菌的一種，常因食物及水源的污染而引發(fā)人和動(dòng)物的感染，特別是在初生動(dòng)物中有很高的發(fā)病率、死亡率，制約了養(yǎng)殖行業(yè)的發(fā)展，同時(shí)威脅了人類(lèi)的健康。研究發(fā)現(xiàn)，其主要致病因子是腸毒素和黏附素。Etp A屬于黏附素中的一種，分子量較大，能與腸上皮細(xì)胞上的特異性受體結(jié)合，在細(xì)菌和腸壁之間形成分子橋，介導(dǎo)ET EC的黏附。E tpA在不同血清型

2、的E TEC中表達(dá)高度保守，同源性很高。另有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Etp A具有良好的免疫原性，能夠有效阻止ETEC對(duì)腸道上皮細(xì)胞的黏附。這一發(fā)現(xiàn)為預(yù)防ETEC引起的動(dòng)物腹瀉，開(kāi)拓了新的思路。
　　為了降低由ETEC造成的經(jīng)濟(jì)損失，減弱ETEC對(duì)動(dòng)物健康的損害，在尋找有效的預(yù)防辦法的同時(shí)，提高動(dòng)物的免疫功能也至關(guān)重要。動(dòng)物腸道面積巨大，其中聚居著數(shù)量龐大的微生物菌群稱(chēng)為腸道菌群；腸道黏膜還擁有豐富的免疫細(xì)胞及免疫分子，參與構(gòu)成機(jī)體抵御病原微生

3、物侵入的腸道黏膜免疫系統(tǒng)。其中有益菌群的增加能調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，豐富菌群多態(tài)性，促進(jìn)腸道黏膜生長(zhǎng)，刺激腸黏膜分泌免疫分子，提高腸道黏膜免疫功能，幫助機(jī)體抵御病原微生物的侵襲。
　　釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）是酵母菌科（Saccharomycetaceae），酵母菌屬（Saccharomycodes）的成員，屬于益生菌的一種。在研究其益生作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，它含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和未知生長(zhǎng)因子，能提

4、高動(dòng)物的生產(chǎn)性能，促進(jìn)腸道黏膜發(fā)育，增加有益菌群的數(shù)量，增強(qiáng)腸道黏膜免疫功能。本課題組通過(guò)基因克隆、同源重組等技術(shù)，使大腸桿菌黏附素 Etp A在釀酒酵母菌中高效表達(dá)，成功構(gòu)建出Etp A酵母工程菌。并在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Etp A酵母工程菌能有效阻止ETEC對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附，具有保護(hù)上皮細(xì)胞的作用。
　　本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)：
　　1.本研究選取斷奶日齡21d的SPF級(jí)健康SD大鼠120只，雌雄各半。隨機(jī)分為3組

5、：空白對(duì)照組、釀酒酵母菌組（以下簡(jiǎn)稱(chēng)為釀酒酵母組）、Etp A酵母工程菌組（以下簡(jiǎn)稱(chēng)為Etp A組），每組40只，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)期間分別給3組大鼠灌服生理鹽水、107CFU/mL釀酒酵母菌菌液、107 CFU/mL EtpA酵母工程菌菌液，每天1次，每次2mL/只，共持續(xù)28d；然后連續(xù)3d灌服108 CFU/mL大腸桿菌（H10407）菌液，每天1次，每次5 mL/只。分別于實(shí)驗(yàn)第7、14、21、28d和結(jié)束灌服大腸桿菌菌液3d后，取

6、各組大鼠糞便。通過(guò)末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（T-RFLP）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、pH值檢測(cè)技術(shù)，研究了Etp A酵母工程菌對(duì)腸道菌群OTU（微生物可操作單元）和pH值的影響，以及對(duì)腸道重要菌群：類(lèi)桿菌（Bacteriodes）、梭菌（Clostridium）、腸球菌（Enterococcus）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）、乳桿菌（Lactobacillaceae）數(shù)量的影響。
　　2.本研究分別于實(shí)驗(yàn)第7、14、2

7、1、28d和結(jié)束灌服大腸桿菌菌液3d后，采集大鼠十二指腸、空腸、回腸組織。通過(guò)組織切片觀察、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究了Etp A酵母工程菌對(duì)十二指腸、空腸、回腸絨毛長(zhǎng)度、寬度、腸隱窩深度、絨毛長(zhǎng)度/隱窩深度（ V/C）的影響；對(duì)腸道黏膜中重要免疫分子：分泌型免疫球蛋白A（SIgA）、白介素-2（IL-2）、白介素-4（IL-4）及干擾素-γ（IFN-γ）分泌量的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　

8、　1. EtpA酵母工程菌對(duì)腸道菌群的影響：
　　（1）Etp A酵母工程菌對(duì)腸道菌群多態(tài)性的影響：釀酒酵母組和Etp A組的OTU值在7、14、21、28d均高于空白對(duì)照組，并在第14d達(dá)到最大值，均與空白對(duì)照組差異極顯著（P＜0.01），但釀酒酵母組和Etp A組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。灌服ETEC后，EtpA組與灌服前無(wú)明顯差異（P＞0.05），且顯著高于釀酒酵母組（P＜0.05），極顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01）

9、。
　　（2）Etp A酵母工程菌對(duì)腸道重要菌群的影響：釀酒酵母組和Etp A組的重要菌群數(shù)量在7~28d均高于空白對(duì)照組。①釀酒酵母組和 EtpA組的類(lèi)桿菌數(shù)量在第21d、28d顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05），釀酒酵母組和EtpA組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。灌服ETEC后，EtpA組與灌服前無(wú)明顯差異（P＞0.05），且極顯著高于釀酒酵母組和空白對(duì)照組（P＜0.01）。②釀酒酵母組和Etp A組的梭菌數(shù)量在第14d增長(zhǎng)量

10、最大，且14d、28d時(shí)，均極顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01），釀酒酵母組和Etp A組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。灌服ETEC后，僅有空白對(duì)照組顯著高于灌服前（P＜0.05），與釀酒酵母組、EtpA組均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。③釀酒酵母組和EtpA組的腸球菌數(shù)量在第14d出現(xiàn)顯著增長(zhǎng)，于第21d，極顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01），釀酒酵母組和 Etp A組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。灌服ETEC后，EtpA組與灌服前無(wú)明

11、顯差異（P＞0.05），空白對(duì)照組、釀酒酵母組均顯著高于灌服前（P＜0.05），各組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。④釀酒酵母組和Etp A組的雙歧桿菌數(shù)量從第7d起明顯增高，于第14d，極顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01），釀酒酵母組和Etp A組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。灌服 ETEC后， Etp A組與灌服前無(wú)明顯差異（P＞0.05），顯著高于釀酒酵母組（P＜0.05），極顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01）。⑤釀酒酵母組和 E

12、tp A組的乳桿菌數(shù)量在第14d、21d，極顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01），釀酒酵母組和 Etp A組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。灌服ETEC后，各組均出現(xiàn)下降，Etp A組極顯著高于空白對(duì)照組和釀酒酵母菌組（P＜0.01）。
　　（3）Etp A酵母工程菌對(duì)腸道菌群pH的影響：實(shí)驗(yàn)第7~28d，釀酒酵母組和Etp A組的p H值呈下降趨勢(shì)，在第21d，均顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05），釀酒酵母組和EtpA組間無(wú)顯著差異

13、（P＞0.05）。灌服ETEC后，空白對(duì)照組pH值顯著升高（P＜0.05），極顯著高于釀酒酵母組和Etp A組，釀酒酵母組和 Etp A組間差異顯著（P＜0.05）。
　　2. EtpA酵母工程菌對(duì)腸道黏膜免疫的影響：
　?。?）Etp A酵母工程菌對(duì)腸道黏膜結(jié)構(gòu)的影響：①釀酒酵母組和EtpA組的小腸各段絨毛長(zhǎng)度在7~28d均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，均于第28d達(dá)到最大值，其中空腸絨毛長(zhǎng)度極顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01），釀酒酵母組

14、和 Etp A組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。灌服 ETEC后，空白對(duì)照組和釀酒酵母組的空腸絨毛長(zhǎng)度極顯著下降（P＜0.01），與 EtpA組差異極顯著（P＜0.01）。②釀酒酵母組和EtpA組的小腸各段絨毛寬度在實(shí)驗(yàn)中均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。③釀酒酵母組和Etp A組的空腸隱窩深度在第28d，顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05），釀酒酵母組和Etp A組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。灌服ETEC后，各組的空腸隱窩深度極顯著升高（P

15、＜0.01）， Etp A組極顯著低于空白對(duì)照組和釀酒酵母組（P＜0.01）。④釀酒酵母組和Etp A組空腸、回腸V/C值均在28d達(dá)到最大最，且在第28d時(shí)空腸V/C值極顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01），釀酒酵母組和 Etp A組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。灌服ETEC后，空白對(duì)照組空腸 V/C值極顯著下降（P＜0.01），且極顯著低于釀酒酵母組和Etp A組（P＜0.01）；釀酒酵母組回腸V/C值顯著下降（P＜0.05），且顯著

16、低于Etp A組（P＜0.05）。
　　（2）EtpA酵母工程菌對(duì)腸道黏膜中SIgA的影響：實(shí)驗(yàn)第7~28d，釀酒酵母組和EtpA組的SIgA含量呈上升趨勢(shì)，于第21d達(dá)到最大值，均極顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01），釀酒酵母組和Etp A組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。灌服ETEC后，各組均極顯著下降（P＜0.01），Etp A組極顯著高于空白對(duì)照組和釀酒酵母菌組（P＜0.01）。
　?。?）EtpA酵母工程菌對(duì)腸道黏膜

17、中重要細(xì)胞因子的影響：實(shí)驗(yàn)第7~28d，釀酒酵母組和EtpA組的IL-2、IL-4、IFN-γ呈上升趨勢(shì)，在第14d，IL-2的相對(duì)增長(zhǎng)倍數(shù)最大，與空白對(duì)照組差異極顯著（P＜0.01）；從第14d起 IL-4、IFN-γ快速增長(zhǎng)，在第21d、28d，均極顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01），釀酒酵母組和Etp A組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。灌服ETEC后，空白對(duì)照組和釀酒酵母菌組的IL-2、IL-4、IFN-γ均極顯著變化（P＜0.0

18、1），IL-2、IL-4的含量極顯著低于EtpA 組（P＜0.01），IFN-γ的含量極顯著高于EtpA組（P＜0.01）。
　　綜合以上結(jié)果得到以下結(jié)論：
　　1. EtpA酵母工程菌具有釀酒酵母的益生作用：能有效促進(jìn)小腸黏膜的發(fā)育，加強(qiáng)腸道黏膜的吸收功能；豐富腸道菌群多態(tài)性，增加重要菌群數(shù)量；降低腸道菌群pH值；刺激腸道黏膜中重要免疫分子的分泌，加強(qiáng)腸道黏膜免疫功能。
　　2.從灌服第7d起隨著灌服天數(shù)的