具有氨氧化功能大腸桿菌工程菌的構(gòu)建.pdf

1、水污染是一個重要的環(huán)境問題，氮素是水體的主要污染源之一。目前采用硝化-反硝化工藝去除污水中的氮素，氨氧化細菌是氮素去除中起主要作用的微生物，可將氨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為亞硝態(tài)氮。但因其生長速率緩慢，較難培養(yǎng)且不易分離到純種菌株，仍然是污水脫氮處理的一個限制性因素。因此，構(gòu)建快速生長、易培養(yǎng)的生物脫氮菌株將促進生物脫氮技術(shù)的發(fā)展。
　　本研究從土壤富集液中克隆了氨氧化細菌的兩個功能基因（amoA基因和hao基因），并將這兩個基因共同表達于大腸桿

2、菌BL21(DE3)中，構(gòu)建了具有氨氧化功能的大腸桿菌工程菌。本論文的研究結(jié)果如下:
　　(1)從土壤富集液中提取DNA，利用氨氧化細菌的特異引物PCR擴增amoA和hao基因序列，PCR產(chǎn)物分別連接克隆載體pMD18-T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)菌落PCR篩選，挑選目標片段的重組子測序及Blast分析，獲得兩種功能基因序列。結(jié)果表明amoA和hao基因分別與Nitrosomonas sp.GH22和Nitrosomonas sp

3、.ENI-11序列同源相似性達到99％。
　　(2)采用生物信息學(xué)對AmoA和Hao結(jié)構(gòu)和功能進行分析，結(jié)果表明:AmoA氨基酸全長為276個，分子質(zhì)量為31.94 kDa，屬于不穩(wěn)定的疏水性蛋白，該蛋白含有6個潛在跨膜螺旋區(qū)，三級結(jié)構(gòu)顯示空間構(gòu)象不對稱;Hao氨基酸全長為570個，分子質(zhì)量為64.27 kDa，屬于穩(wěn)定的親水性蛋白，該蛋白含有1個潛在跨膜螺旋區(qū)，三級結(jié)構(gòu)顯示空間構(gòu)象不對稱。
　　(3)將amoA和hao基因

4、分別連接到表達載體pQE30和pET28a，構(gòu)建重組原核表達載體pQE30-amoA和pET28a-hao，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中，RT-PCR證實基因得到表達，然后測定AmoA和Hao粗酶液活性。以硫酸銨為底物，AmoA粗酶液的氨氮降解率為90.6％，以鹽酸羥胺為底物，Hao粗酶液的羥胺降解率為86.3％，說明AmoA和Hao蛋白粗酶液具有一定的酶活性。
　　(4)質(zhì)粒pQE30-amoA和pET28a-hao，同

5、時轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)過雙抗平板和菌落PCR篩選后，得到重組菌BL21(DE3)-pQE30-amoA-pE T28a-hao，RT-PCR證實兩個基因均在重組菌中得到表達，擴大培養(yǎng)，測定此菌株的氨氮降解能力，培養(yǎng)60 h后氨氮的最大降解率達到92.0％，說明菌株BL21(DE3)-pQE30-amoA-pET28a-hao具有一定的脫氮活性。
　　綜上所述，本研究構(gòu)建了一株具有氨氧化功能的大腸桿菌工程菌，在氨氮污水