大腸桿菌基因工程菌生產番茄紅素研究.pdf

1、番笳紅素是一種重要的類胡蘿卜素，具有較強的抗氧化活性，能阻止低密度脂蛋白(LDL)和膽固醇的氧化，防止動脈粥樣硬化和冠心病發(fā)生以及防治肺癌，膀胱癌，宮頸癌和皮膚癌等。近年來，番茄紅素的制備工藝，特別是發(fā)酵法生產，受到研究人員的重視。 所有類胡蘿卜素均是由共同的前體異戊烯焦磷酸(IPP)合成而來的。異戊烯焦磷酸(IPP)的合成是通過典型的甲羥戊酸途徑或發(fā)現(xiàn)不久的非甲羥戊酸途徑合成的。在大腸桿菌中，IPP的生物合成是由中心代謝途徑的

2、中間產物丙酮酸和3-磷酸甘油醛(G3P)分支合成的。 該研究中，我們在大腸桿菌工程菌(攜帶含歐文氏菌crtE，crtI和crtB基因的pACCRT-EIB質粒，該質粒有p15A復制起點，基因由自身的啟動子控制)中過表達了能轉化IPP為番茄紅素的法尼基焦磷酸合成酶(jspA)和異戊烯焦磷酸異構酶基因(idi)，通過控制中心碳代謝促進番茄紅素合成。另外，結合代謝工程策略和優(yōu)化過程的實驗以使番茄紅素產量最大化。主要內容如下：

3、(1)從破壁方法、浸提溶劑及提取條件等方面對大腸桿菌工程菌番茄紅素提取工藝進行了優(yōu)化研究。結果表明酸-熱法是大腸桿菌工程菌破壁提取番茄紅素的最佳方法；丙酮是理想的提取溶劑。對破壁的條件(包括破壁的溫度、時間、酸的濃度及添加量等)和提取的條件(包括浸提溶劑的添加量及浸提溫度、時間等)進行了分析研究。優(yōu)化得到適宜的破壁和提取條件為：鹽酸濃度為4mol/L、鹽酸溶液用量10 mL/g(濕菌體)、破壁溫度35℃、破壁時間20min、丙酮添加量2

4、0mL/g(濕菌體)、浸提溫度為40℃、浸提時間為2h、浸提級數(shù)為2次。 (2)研究了碳源、無機氮源、刺激物等對工程菌生長及色素累積的影響，確定了合適的培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基為改良LB+M9培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母粉5 g/L；甘油20 g/L；Na<,2>HPO<,4>．7H<,2>O 12.8 g/L；CaCl<,2>0.022 g/L；KH<,2>PO<,4> 3 g/L； NaCl 0.5 g/L；MgSO<,4> 0.

5、48 g/L；NH<,4>Cl l g/L；(NH<,4>)<,2>SO<,4>10 g/L；富馬酸鈉2 g/L；pH 7.0。)；培養(yǎng)溫度為33℃。發(fā)酵完成后工程菌的生物量(干重)為6.48g/L，番茄紅素的最高含量可達10.6mg/L。 (3)jspA，idi和，spA-idi基因的克隆和表達：法尼基焦磷酸到櫳牛兒櫳牛兒焦磷酸的轉化是在大腸桿菌工程菌中合成類胡蘿卜素的第一瓶頸，其次是異戊烯焦磷酸的異構和法尼基焦磷酸的合成。移

6、走這些瓶頸將會提供足夠的前體來合成番茄紅素等類胡蘿卜素。我們分別克隆了大腸桿菌DH5 Cc異戊烯焦磷酸異構酶(由idi基因編碼)基因和法尼基焦磷酸合成酶(由ispA編碼)基因。兩個基因以及基因連接產物分別與歐文氏菌的基因簇(crtEIB)被導入大腸桿菌以產生抗氧化的橘紅色番茄紅素。番茄紅素產量測定結果表明，工程菌DH5Cα(pACCRT-EIB，pUC19-ispA-idi)單位產量和單位體積產量分別提高了68.88﹪、68.92﹪。說

7、明，引入的idi和ispA基因能夠提高原來基因工程菌的番茄紅素產量。 (4)構建了基因工程菌BL21(DE3)(pACCRT-EIB，pET28a(+)-ispA-idi)，但菌生長緩慢，番茄紅素產量下降。構建的重組質粒pET-28a-ispa-idi-EIB導入BL21(DE3)后，雖然能成功的合成番茄紅素，但由于菌體生長受到嚴重影響，番茄紅素產量十分低下。 (5)在搖瓶初步優(yōu)化條件基礎上進行了7L罐發(fā)酵實驗，在更為優(yōu)化的pH