大腸桿菌萜類合成途徑關(guān)鍵基因的篩選及其產(chǎn)番茄紅素的研究.pdf

1、萜類化合物是一類以異戊二烯為結(jié)構(gòu)單元，有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值的化合物。番茄紅素是一類在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的萜類化合物。與所有的萜類化合物一樣，番茄紅素是由萜類通用前體物質(zhì)——異戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)聚合裝配合成的。兩種通用前體物質(zhì)IPP&DMAPP在生物體內(nèi)主要有兩條生成途徑:甲羥戊酸途徑(mevalonate pathway，MVA pathway)和2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(2-meth

2、yl-D-erythritol-4-phosphate pathway，MEP pathway)生物合成途徑。其中異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(isopentenyl diphosphate isomerase，IDI)是萜類化合物合成途徑中的關(guān)鍵酶，調(diào)控著IPP和DMAPP在整個(gè)途徑中平衡配比，也是代謝工程改造的主要靶點(diǎn)。
　　本研究以大腸桿菌為細(xì)胞工廠，對(duì)萜類化合物合成途徑中的關(guān)鍵基因idi進(jìn)行系統(tǒng)性優(yōu)化，并且以獲得高水平合成番茄紅素

3、的工程菌株為主要目的。篩選并克隆了原核微生物、真核微生物、植物、古菌等多種來(lái)源的Ⅰ型及Ⅱ型異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(IDI)基因，并構(gòu)建于表達(dá)載體pSB1s上，在大腸桿菌E.coli中異源表達(dá)。并且分別在MEP途徑和MVA途徑的背景菌株中進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物對(duì)比。
　　在強(qiáng)化MEP途徑的工程菌株P(guān)X中，將不同來(lái)源的IDI的重組載體，以及番茄紅素代謝途徑的質(zhì)粒pLY10-2Rk同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)表達(dá)，在低背景的菌株中看到不同來(lái)源IDI對(duì)于MEP菌

4、株番茄紅素的產(chǎn)量存在明顯的影響;同時(shí)在引入外源MVA途徑的大腸桿菌菌株中，共轉(zhuǎn)化pLY10-2Rk以及不同來(lái)源的IDI重組載體，發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源的IDI對(duì)于MVA途徑的背景菌株產(chǎn)番茄紅素也存在較大差別，說(shuō)明同一種IDI在兩條途徑中表現(xiàn)出不一樣的活性。
　　為構(gòu)建高水平產(chǎn)番茄紅素的工程菌株，分別在MEP途徑中，利用異源IDI協(xié)同相關(guān)途徑靶點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化，即在PXDF菌株中協(xié)同表達(dá)IDI及DXS，在對(duì)菌株產(chǎn)番茄紅素能力進(jìn)行檢測(cè)后，釀酒酵母來(lái)源

5、的Ⅰ型IDI(ScIDI)及芽孢桿菌來(lái)源的Ⅱ型IDI(BsIDI)在經(jīng)優(yōu)化的背景下可以獲得最高的番茄紅素產(chǎn)量，產(chǎn)量分別達(dá)到9.96mg/g DCW，8.78 mg/g DCW。
　　限于MEP途徑的局限特點(diǎn)，于是借助于OLMA的DNA組裝方法，利用在MVA途徑中優(yōu)良的PtIDI，對(duì)番茄紅素的代謝模塊進(jìn)行了優(yōu)化篩選，最終得到的工程菌株產(chǎn)量得到57.78mg/g DCW。本研究篩選獲得了分別適用于MEP和MVA途徑的IDI，優(yōu)化后的M