18823.大腸桿菌中mva途徑的構(gòu)建及其產(chǎn)異戊二烯的研究

1、分類號：密級：UDC：學(xué)號：405604612026南昌大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文大腸桿菌中大腸桿菌中MVA途徑的構(gòu)建及其產(chǎn)異戊二烯的研究途徑的構(gòu)建及其產(chǎn)異戊二烯的研究ConstructionoptimizationofthemevalonatepathwayinEscherichiacolifproductionofisoprene馮凡培養(yǎng)單位（院、系）：南昌大學(xué)生命科學(xué)院指導(dǎo)教師姓名、職稱：許楊教授申請學(xué)位的學(xué)科門類：理學(xué)學(xué)科專業(yè)名稱：

2、微生物學(xué)論文答辯日期：20150529答辯委員會主席：評閱人：年月日摘要I摘要摘要異戊二烯（C5H8）是一種重要的C5平臺化合物，是萜類化合物的基本組成單元。作為重要的化工原料，可用于合成與天然橡膠性能非常接近的生物橡膠。此外，異戊二烯還可應(yīng)用于合成各種萜類化合物，廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥、醫(yī)藥、香料及粘結(jié)劑等領(lǐng)域。隨著石油資源的日益枯竭，發(fā)展不依賴石油資源的生物基C5平臺化學(xué)品已成為實現(xiàn)經(jīng)濟(jì)社會可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略需求。自然界中，異戊二烯和萜類化合

3、物都采用了相類似的合成途徑。即C甲基D赤蘚糖醇4磷酸途徑(MEPpathway)和甲羥戊酸代謝途徑(MevalonatepathwayMVApathway)。本研究通過在大腸桿菌中引入外源MVA途徑，成功的構(gòu)建了產(chǎn)異戊二烯工程菌，并通過合成生物學(xué)和代謝工程手段對MVA途徑進(jìn)行優(yōu)化，為異戊二烯的大規(guī)模生物合成提供了基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容如下：1.異戊二烯產(chǎn)量氣相檢測方法的建立以異戊二烯標(biāo)準(zhǔn)品作為定量標(biāo)準(zhǔn)。系統(tǒng)采用AgilentTechbolo

4、gies7890AGCsystem型氣相色譜儀，色譜柱為HP55%phenylmethylsiloxan(30m320μm0.25μm)，檢測器為火焰離子化檢測器；氣化室溫度50℃，柱箱溫度240℃，檢測器溫度280℃。得到了異戊二烯產(chǎn)量與檢測峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.不同物種異戊二烯合成酶的克隆表達(dá)從蒙古櫟、斛櫟、麻櫟、遼東櫟、夏橡以及楊樹的基因組中克隆出異戊二烯合成酶基因構(gòu)建了到表達(dá)載體pBADHisB中，分別與pYESs和pSPMIc

5、共轉(zhuǎn)化到E.coliBW25113得到重組菌，通過自誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白得到成功表達(dá)，其中BW01菌的異戊二烯的產(chǎn)量為451.4mgL。3.表達(dá)載體的優(yōu)化對于異戊二烯產(chǎn)量的提高對重組菌內(nèi)的三個表達(dá)載體分別采用增加稀有密碼子AGA、使用不動強度啟動子以及改變表達(dá)載體拷貝數(shù)等方式調(diào)控關(guān)鍵基因在宿主菌內(nèi)的表達(dá)，從而改變重組菌株產(chǎn)異戊二烯的能力，最優(yōu)的菌株BW12異戊二烯產(chǎn)量達(dá)到了1341.6mgL，比未優(yōu)化前提高了197.2%。4.遺傳背景的改造