大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)四氫嘧啶的途徑構(gòu)建及代謝改造.pdf

1、分類號：TQ922密級：公開研究生學(xué)號：13809960學(xué)校代碼：10057大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)四氫嘧啶的途徑構(gòu)建及代謝改造PathwayconstructionandmetabolicengineeringforfermentativeproductionofectoineinEscherichiacoli專業(yè)名稱：輕工技術(shù)與工程指導(dǎo)教師姓名：陳寧教授研究生姓名：寧義科申請學(xué)位級別：全日制工程碩士論文提交日期：2016年1月論文課題來源：

2、自選課題學(xué)位授予單位：天津科技大學(xué)摘要四氫嘧啶作為一種對蛋白、核酸、生物膜及整個細胞的保護劑和穩(wěn)定劑以及滲透壓平衡物質(zhì)，越來越多的受到人們的關(guān)注。由于其合成途徑僅存在于一些中度嗜鹽微生物中，生產(chǎn)工藝復(fù)雜、成本高、產(chǎn)量低，本研究通過在大腸桿菌中引入四氫嘧啶合成途徑構(gòu)建出一株不依賴鹽激誘導(dǎo)的四氫嘧啶工程菌，并通過系統(tǒng)代謝改造提高了其產(chǎn)率。(1)首先以pTrc99a質(zhì)粒為載體克隆Halomonaselongata中四氫嘧啶合成所需關(guān)鍵基因ec

3、tABC到大腸桿菌W3110、MGl655和K27中，發(fā)酵結(jié)果表明在大腸桿菌中重構(gòu)四氫嘧啶合成途徑成功，發(fā)酵液中四氫嘧啶積累量分別為：488007g／L、414士002g／L和297士008g／L。(2)根據(jù)大腸桿菌對遺傳密碼的偏好性對ectABC基因簇做密碼子優(yōu)化后，搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示四氫嘧啶積累量下降了846％，并未達到預(yù)期的優(yōu)化效果?？紤]到pTrc99a質(zhì)?？截悢?shù)過高，通過將其替換為一個拷貝數(shù)較低的pWSK29后最終發(fā)酵液中四氫嘧啶

4、積累量大幅下降。(3)然后選擇W3110作為細胞底盤，分別通過敲除lysA和thrA基因以阻斷、弱化競爭抑制支路構(gòu)建了W3110(pTrECTAlysA)和W3110(pTrECTAthrA)兩株工程菌，搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示發(fā)酵液中四氫嘧啶積累量分別提高496％和1091％。而當(dāng)lysA和砌刪被同時敲除后四氫嘧啶積累量下降了389％。(4)之后選擇回補EcolilysC和CglutamicumlysC基因以增加天冬氨酸激酶活性，構(gòu)建雙質(zhì)粒工

5、程菌W3110(pTrECTpSTVLysCEC，AthrA)矛HW3110(pTrECTpSTVLysCCG，AthrA)，搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示發(fā)酵液中四氫嘧啶積累量分別提高31％和92％，天冬氨酸到L天冬氨酸B半醛合成途徑得到強化從而提高了四氫嘧啶產(chǎn)量。(5)最后通過敲除iclR基因打開乙醛酸循環(huán)并替換ppc基因啟動子為trc強啟動子以增加天冬氨酸前體物草酰乙酸的供應(yīng)，最終發(fā)酵液中四氫嘧啶積累量達到13601g／L，并未檢測到有草酰乙酸