基于代謝工程改造大腸桿菌生產(chǎn)L-絲氨酸.pdf

1、L-絲氨酸是生物體內(nèi)一種重要的中間代謝產(chǎn)物，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品制造及食品等領(lǐng)域。本文以大腸桿菌為出發(fā)菌株，圍繞 L-絲氨酸的生物合成途徑進行代謝工程改造，旨在以葡萄糖為底物直接發(fā)酵生產(chǎn) L-絲氨酸。通過在大腸桿菌中敲除sdaA、sdaB及tdcG基因，過表達從頭合成途徑中的pgk、serA△197、serC及ser B基因，敲除gcv P基因或者微調(diào)glyA基因的表達水平，降低L-絲氨酸自身的降解或增加前體物的供給，從而有效提高L-

2、絲氨酸的生物合成。
　　本文中采用改進的λRed重組系統(tǒng)首先在Escherichia. coliMG1655中依次敲除了sdaA、sdaB及 tdcG基因，旨在阻斷 L-絲氨酸向丙酮酸方向的分解。得到的三敲除株EJ3在以葡萄糖為碳源的M9培養(yǎng)基中生長正常，比生長速率略有下降，但發(fā)酵上清液中并沒有檢測到L-絲氨酸的積累。
　　利用過表達載體pJH04轉(zhuǎn)化菌株EJ3，成功過表達了L-絲氨酸的從頭合成途徑中的四個基因。其中的關(guān)鍵基

3、因serA受到終產(chǎn)物L(fēng)-絲氨酸的反饋抑制，過表達載體pJH04中通過引入谷氨酸棒狀桿菌脫敏性的serA△197解除了合成途徑中的反饋抑制。過表達菌株EJ3(pJH04)的發(fā)酵上清液中積累了73.2 mg/l的L-絲氨酸，但隨著發(fā)酵的進行積累的L-絲氨酸仍會被分解掉，另外由于質(zhì)粒的導(dǎo)入等原因，過表達菌株EJ3(pJH04)菌體的生物量減少。
　　針對L-絲氨酸向甘氨酸方向的分解，采用兩種方式進行調(diào)節(jié)：（1）構(gòu)建敲除gcvP基因的片段

4、，轉(zhuǎn)化菌株EJ3(pJH04)，以阻斷甘氨酸的裂解途徑，通過增加甘氨酸的量間接提高L-絲氨酸的積累。敲除gcv P基因得到的菌株EJ4(pJH04)在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)14 h時積累了200.5 mg/l的L-絲氨酸，是菌株EJ3(pJH04)L-絲氨酸積累量的2.7倍。（2）構(gòu)建置換 glyA基因 RBS序列的片段，轉(zhuǎn)化菌株EJ3(p JH04)，通過減弱glyA基因的翻譯水平直接提高L-絲氨酸的積累。13個RBS突變株中菌株S20(pJH