黃色短桿菌載體系統(tǒng)的構建及其產L-纈氨酸代謝工程育種的初步研究.pdf

1、自人們首次分離到生產L-谷氨酸的谷氨酸棒狀桿菌以來,非致病性土壤棒桿菌的三個主要代表種:谷氨酸棒狀桿菌、黃色短桿菌和乳糖發(fā)酵短桿菌,已經被廣泛用于氨基酸的工業(yè)化生產。目前代謝工程育種已經成為棒狀桿菌菌種改良的主要策略。可應用于棒狀桿菌的載體系統(tǒng),是棒狀桿菌分子生物學研究以及代謝工程育種的基礎。由于自身存在缺點,已有的棒狀桿菌載體在某些情況下不適合用于代謝工程研究。本研究主要進行了新的黃色短桿菌載體系統(tǒng)的構建工作,并進行了黃色短桿菌產L-

2、纈氨酸代謝工程育種的初步研究。主要研究結果如下:
　　 (1)構建了一個新型E.coli-B.flavum穿梭型誘導表達載體pDXW-8。pDXW-8有如下特點:pDXW-8具有大腸桿菌復制起點oriE,棒狀桿菌雙鏈復制起點dso及單鏈復制起點sso;具有兩個抗生素抗性標記-青霉素抗性基因amp和和那霉素抗性基因kan;使用tac啟動子表達目的基因;使用lacPF104來控制tac啟動子的轉錄;具有一個長的多克隆位點MCS。與已

3、經存在的棒狀桿菌表達載體相比,pDXW-8最主要的優(yōu)點有兩個:一是它的MCS包含多達11個單限制性內切酶切點,這保證了載體可以非常方便地用于克隆攜帶許多限制性內切酶位點的DNA片段以及同一代謝途徑中的多個基因;另一個主要優(yōu)點是lacPF104基因可以嚴格控制tac啟動子的轉錄,確保了有毒基因在棒狀桿菌中的誘導表達。在大腸桿菌、黃色短桿菌和谷氨酸棒桿菌中使用載體pDXW-8表達vhb基因的實驗證明:pDXW-8是一個適用于棒狀桿菌代謝工程

4、研究的新型載體。
　　 (2)構建了一個新的大腸桿菌-黃色短桿菌穿梭型啟動子探測載體pDXW-11。pDXW-11具有大腸桿菌復制起點oriE,棒狀桿菌雙鏈復制起點dso及單鏈復制起點sso;使用卡那霉素抗性基因作為篩選標記。啟動子探測相關區(qū)域有如下特性:rrnBT1T2終止子緊鄰多克隆位點MCS,位于其上游,這阻止了MCS上游潛在啟動子的轉錄通讀;包含7個單切點序列的MCS位于報告基因cat的上游;MCS和cat之間具有三個串

5、聯(lián)的終止密碼子,這阻止了潛在的插入片段的翻譯通讀。在黃色短桿菌中應用pDXW-11檢測了6個啟動子,其活性從強到弱的依次為:tac-M,Pkan,tac-Ml,tac,PF104和PilvA。這些啟動子,尤其是強啟動子tac-M,對于棒狀桿菌代謝工程研究具有非常重要的意義。
　　 (3)構建了一個新型E.coli-B.flavum穿梭組成型表達載體pDXW-10。pDXW-10有如下特點:具有大腸桿菌復制起點oriE,棒狀桿菌雙

6、鏈復制起點dso及單鏈復制起點sso;具有卡那霉素抗性基因kan;具有一個長的多克隆位點MCS;使用tac-M啟動子表達目的基因。與已有的棒狀桿菌表達載體相比,pDXW-10有如下優(yōu)點:首先,長的MCS非常方便用來克隆DNA大片斷;第二,在tac-M啟動子的控制下,插入的目的基因進行中度水平的表達,而中度水平的酶量非常適合于細胞代謝產物的生產;第三,是克隆在載體中的基因在棒狀桿菌中實施組成型表達,這非常有益于工程菌株的大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生

7、產目的產物;第四,在E.coli中使用。pDXW-10表達目的基因時仍需要IPTG的誘導,這將有助于克隆那些用于棒狀桿菌代謝工程改造而對E.Coli細胞有毒性的基因。在大腸桿菌和黃色短桿菌中應用載體pDXW-10表達氯霉素?；D移酶CAT,結果CAT在大腸桿菌呈現(xiàn)高水平表達,在黃色短桿菌呈現(xiàn)中度水平表達。pDXW-10是用于棒狀桿菌代謝工程研究的一個理想的表達載體。
　　 (4)初步構建了可應用于黃色短桿菌基因無痕敲除和替代的整

8、合型載體pDXW-3。通過轉化實驗證明已有的用于棒桿菌基因敲除及替代的整合型載體pK18mobsacB在黃色短桿菌B.flavum ATCC14067中轉化效率非常低,不能用于黃色短桿菌基因的無痕敲除和替代研究。pDXW-3能高效轉化B.flavum ATCC14067,以kan作為正向篩選標記,使用lac-M啟動子的sacB基因作為反向篩選標記,可用于黃色短桿菌基因無痕敲除和替代。
　　 (5)初步構建了一株過量積累L-纈氨酸

9、的黃色短桿菌工程菌株。從谷氨酸棒桿菌模式菌株C glutamicum ATCC13032中克隆出L-纈氨酸合成途徑上的限速酶-乙酰羥酸合酶編碼基因ilvBN。對ilvBN進行定點突變,獲得其抗反饋抑制突變型ilvBNr。以大腸桿菌-黃色短桿菌穿梭表達載體pDXW-10為基礎,構建重組質粒pDXW-10-ilvBNr,并轉化野生型黃色短桿菌B.flavum ATCC14067,獲得工程菌株ATCC14067/pDXW-10-ilvBNr。