鈍齒棒桿菌精氨酸代謝工程的初步研究.pdf

1、L-精氨酸（L-arginine，L-Arg）是合成細(xì)胞漿蛋白、核蛋白和肌酸的重要前體，同時也是人和動物體內(nèi)一種半必需堿性氨基酸。隨著對L-Arg功能研究的不斷深入，L-Arg已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到食品、醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域，因此其市場需求量在不斷增加。微生物發(fā)酵是L-Arg生產(chǎn)的主要來源，為適應(yīng)市場發(fā)展需要，近年來對L-Arg高產(chǎn)菌株的研究漸漸成為熱點(diǎn)。
　　本文以鈍齒棒桿菌誘變菌為試驗(yàn)菌株，首先采用搖瓶發(fā)酵的方式，研究了培養(yǎng)基組分（碳源

2、、有機(jī)氮源、無機(jī)氮源及無機(jī)鹽離子）及發(fā)酵培養(yǎng)條件（溫度、接種量、初始pH及發(fā)酵液體積）對菌種產(chǎn)L-Arg產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，該菌產(chǎn)L-Arg發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組分為：葡萄糖12％、硫酸銨4.5%、玉米漿2.5%、KH2PO40.005%、MgSO4·7H2O0.01%、FeCl3·6H2O0.01%、MnSO4·H2O0.05%及碳酸鈣3%；最佳發(fā)酵條件是：培養(yǎng)溫度為30℃、接種量為10%、初始pH為7.0及裝液量為15mL/250mL

3、。該菌以最優(yōu)條件發(fā)酵，L-Arg的產(chǎn)量較基礎(chǔ)培養(yǎng)基提高27.7%，達(dá)到了11.23g/L。
　　其次，采用無痕敲除技術(shù)敲除了編碼絲氨酸生物合成支路的serB基因(編碼磷酸絲氨酸磷酸酶)。發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無論有無添加絲氨酸，serB缺失型菌株的生長及葡萄糖的利用均嚴(yán)重的下降，且L-Arg產(chǎn)量也受到顯著的影響。發(fā)酵120h后L-Arg的產(chǎn)量從原始菌株的8.84±0.032g/L分別下降到了1.69±0.120g/L（0mmol L-

4、Ser添加），2.30±0.032g/L（1mmol L-Ser添加），2.48±0.015g/L（10mmol L-Ser添加）。
　　此外，為了提高煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate,NADPH）含量，本研究進(jìn)一步敲除了編碼葡萄糖旁路（Gluconate Bypass,GB）中的關(guān)鍵酶葡萄糖脫氫酶（Glucose Behydrogenase,GDH）

5、的三個同工酶基因Cgl0286，Cgl2134及Cgl2674。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三個編碼GDH的同工酶基因的缺失，細(xì)胞內(nèi)NADPH的含量分別提高了27.4%，29.4%及7.80%。為了提高菌株利用NADPH合成L-Arg的能力，本研究同時采用基因取代方法過表達(dá)精氨酸生物合成途徑中利用NADPH的關(guān)鍵酶基因argC。通過氨基酸自動分析儀分析120h的發(fā)酵液中游離氨基酸含量，結(jié)果表明雙敲除菌株(M4△Cgl213△Cgl2674)、argC

6、過表達(dá)的雙敲除菌株(M4△Cgl213△Cgl2674::argC)和argC過表達(dá)的三敲除菌株（M4Cgl286△Cgl2135△Cgl2674::argC）相比原始菌株，L-Glu、L-Pro，L-Arg含量均有所提高，L-Lys與L-Gly含量有輕微的降低，而L-Cys含量基本沒變化；且argC過表達(dá)的雙敲除菌株（M4△Cgl213△Cgl2674::argC）及三敲菌株（M4△Cgl286△Cgl2135△Cgl2674-::a