大腸桿菌代謝工程生產(chǎn)粘糠酸及5-羥基色氨酸.pdf

1、石油不僅給世界提供了能源，而且還是許多化工原料的來源。然而，石油資源的萎縮以及環(huán)境的惡化迫使人們尋求生產(chǎn)燃料、化學(xué)品以及藥品的替代方法。值得慶幸的是，生物系統(tǒng)代謝途徑的多樣性給自然界提供了極其豐富的化合物資源庫。最近幾年，代謝工程的發(fā)展通過將外源或者非天然合成途徑引入具有遺傳優(yōu)勢的宿主菌中，建立了多種化合物的微生物細胞工廠。在本研究中，我們報道了兩種重要化合物粘糠酸和5-羥基色氨酸(5-HTP)的新的微生物合成方法。
　　粘糠酸是

2、己二酸的合成前體，后者是一種重要的平臺化合物，用于尼龍-6，6及聚氨酯塑料的生產(chǎn)。我們設(shè)計了3條不同的粘糠酸合成途徑，并在大腸桿菌中進行了驗證和優(yōu)化。在第一條途徑中，色氨酸合成途徑的第一個中間體鄰氨基苯甲酸(AA)經(jīng)鄰氨基苯甲酸1，2-加雙氧酶(ADO)和兒茶酚1，2-加雙氧酶(CDO)的催化，經(jīng)兒茶酚轉(zhuǎn)化成粘糠酸。首先，我們從不同微生物中篩選得到高效的ADO和CDO，在5h內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化AA生成超過1g/L的粘糠酸。為了實現(xiàn)從簡單碳源合成

3、粘糠酸，我們通過表達莽草酸途徑的關(guān)鍵酶以及阻斷色氨酸的合成，構(gòu)建了AA的高產(chǎn)菌株。另外，我們發(fā)現(xiàn)通過表達谷氨酰胺合成酶引入谷氨酰胺再生系統(tǒng)顯著提高了AA產(chǎn)量。最終，含有完整途徑的大腸桿菌工程菌株在搖瓶試驗中從簡單碳源產(chǎn)生了389.96±12.46 mg/L的粘糠酸。
　　在第二條途徑中，將水楊酸的生物合成途徑與其部分降解途徑連接，實現(xiàn)了由簡單碳源合成粘糠酸。首先，我們通過引入異分支酸合成酶和異分支酸-丙酮酸裂解酶，將一株苯丙氨酸高

4、產(chǎn)菌株改造成水楊酸高產(chǎn)菌株。重組菌株水楊酸產(chǎn)量可達1.2 g/L，是目前報道的最高產(chǎn)量。接著，我們構(gòu)建了水楊酸的部分降解途徑，包括水楊酸1-加單氧酶(SMO)和兒茶酚1，2-加雙氧酶(CDO)。利用該途徑在5h內(nèi)可以轉(zhuǎn)化水楊酸生成2.3 g/L的粘糠酸。最后，通過整合水楊酸合成及降解模塊，構(gòu)建了粘糠酸的生物合成途徑。經(jīng)過模塊化優(yōu)化，搖瓶實驗中粘糠酸產(chǎn)量在48 h內(nèi)可達1.5 g/L，具有生產(chǎn)放大的前景。
　　在第三條途徑中，我們從

5、肺炎克雷伯氏菌中鑒定了一個新的2，3-二羥基苯甲酸(2，3-DHBA)脫羧酶，并將其應(yīng)用于粘糠酸的生產(chǎn)。我們對該酶的性質(zhì)進行了系統(tǒng)研究，包括最適溫度、最適pH、動力學(xué)參數(shù)以及底物選擇性。在此基礎(chǔ)上，我們通過連接2，3-DHBA的合成和降解途徑，設(shè)計了一條新的粘糠酸合成途徑。通過表達EntCBA以及莽草酸途徑的關(guān)鍵酶，2，3-DHBA的產(chǎn)量達到900mg/L。通過表達2，3-DHBA脫羧酶和CDO實現(xiàn)了轉(zhuǎn)化2，3-DHBA生產(chǎn)粘糠酸。最終

6、，通過途徑整合實現(xiàn)了粘糠酸的生物合成，搖瓶產(chǎn)量為480 mg/L。
　　另外，我們還反向設(shè)計并驗證了一條新的5-HTP的生物合成途徑。該途徑利用相關(guān)酶松散的底物選擇性，并且避免了使用不穩(wěn)定的色氨酸5-羥化酶。首先，通過大腸桿菌自身的TrpDCBA催化，實現(xiàn)了由5-羥基鄰氨基苯甲酸（5-HAA）生產(chǎn)5-HTP。接著，利用一個新的水楊酸5-羥基化酶轉(zhuǎn)化非天然底物AA生成5-HAA。然后，我們實現(xiàn)了由葡萄糖合成5-HAA，并進行了模塊化