大腸桿菌中吲哚丙酮酸的代謝工程研究.pdf

1、吲哚丙酮酸(IPA)是很多物質的通用中間產(chǎn)物和構造組件，這些物質在醫(yī)藥和食品行業(yè)中有著重要價值。IPA同時也有著一系列廣泛的應用，例如作為神經(jīng)系統(tǒng)的治療藥物，護膚品，以及發(fā)光體?；瘜W合成IPA是一個復雜而且代價較高的過程。而利用L-氨基酸氧化酶的生物合成路徑中，其副產(chǎn)物過氧化氫會導致IPA的降解。TdiD作為特異性的色氨酸轉氨酶，利用其進行生物合成可能會成為高效率的IPA合成的替代方案。
　　大腸桿菌菌株W3110，在含有色氨酸的

2、培養(yǎng)基中，會有一定量的IPA基礎產(chǎn)量。本研究用W3110作為出發(fā)菌株，通過代謝工程的方法研究IPA的生物合成。為了提高IPA的產(chǎn)量，實施了以下的策略:第一步，通過在W3110菌株中引入密碼子優(yōu)化的tdiD基因，使IPA的水平從41.54±1.26 mg/L上升到52.54±2.08 mg/L;第二步，在確認了增加苯丙酮酸含量的益處基礎上，構建了重組菌株YL03，進一步提高IPA的產(chǎn)量。YL03的構建是以一個之前文獻中報告過的W3110缺

3、陷型菌株為基礎，重組表達含有不受反饋抑制的DAHP合成酶基因（aroFfbr）和分支酸變位酶/預苯酸脫水酶基因（pheAfbr）的質粒。重組菌株YL03可以積累IPA的數(shù)量達到158.85±5.36 mg/L，這個產(chǎn)量是野生型W3110菌株的3.82倍;第三步，通過將Trc啟動子更換為一系列不同強度的組成型啟動子，并且增加質粒的拷貝數(shù)，來對tdiDco的表達進行優(yōu)化。在這些構建的菌株當中，YL08的IPA產(chǎn)量最高，可達到236.42±1

4、7.66 mg/L。這個IPA最高產(chǎn)量是野生型W3110產(chǎn)量的5倍以上。最后，本研究評估了敲除以及過表達色氨酸酶基因（tnaA）對IPA生物合成的影響。敲除tnaA會引起IPA水平的輕微下降，而過表達tnaA則會造成產(chǎn)量相當嚴重地減少。
　　本論文還對Terrequinone A在大腸桿菌中的生物合成進行了初步探討。TerrequinoneA合成通路包括tdiA-tdiE五個基因，通過tdiD得到IPA是其中的第一步。利用不同拷貝