大腸桿菌積累丙酮酸的研究.pdf

1、丙酮酸是機(jī)體代謝的中間產(chǎn)物，在大腸桿菌中處于糖酵解途徑的末端，它連接著EMP途徑和TCA循環(huán)，一般用大腸桿菌發(fā)酵不會(huì)積累丙酮酸。但是在對(duì)大腸桿菌進(jìn)行基因工程改造后，發(fā)現(xiàn)有丙酮酸出現(xiàn)，譬如lpdA基因敲除后的大腸桿菌。 lpdA基因編碼的硫辛酰胺脫氫酶(lipoamide dehydrogenase,LPD)是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(pyruvate dehydrogenase complex,PDHc)的組成成分。有氧條件下，大腸桿

2、菌中的PDHc是連接糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，在其催化作用下丙酮酸氧化脫羧生成乙酰輔酶A，該酶的缺陷會(huì)導(dǎo)致丙酮酸的積累。本文重點(diǎn)考察了lpdA基因敲除大腸桿菌(Escherichia coli lpdA<'->)在不同碳源下積累丙酮酸的情況，并在此基因基礎(chǔ)上，設(shè)想進(jìn)一步敲除多個(gè)基因，構(gòu)建出新的基因敲除的菌株，從分子水平考察新菌株對(duì)丙酮酸積累的影響。 第一，比較了敲除lpdA基因前后大腸桿菌的代謝情況，發(fā)現(xiàn)Escherich

3、ia colilpdA<'->與野生型菌株相比，能夠積累較高濃度的丙酮酸，而一般野生型菌株基本不積累丙酮酸。以葡萄糖為碳源對(duì)Eschercihia coli lpdA<'->進(jìn)行游離培養(yǎng)，考察pH值、底物葡萄糖濃度等因素對(duì)丙酮酸積累情況的影響。發(fā)現(xiàn)lpdA基因敲除后，由于丙酮酸的積累，培養(yǎng)基pH值會(huì)迅速下降，影響菌體生長代謝，因此維持pH=7對(duì)Escherichia coli lpdA<'->非常重要。通過對(duì)Escherichia co

4、li lpdA<'->的考察，最終獲得了該菌株的一系列基本發(fā)酵參數(shù)：pH值恒定在7，有氧條件下培養(yǎng)20h后，30g/L葡萄糖基本耗盡，最高菌體濃度能達(dá)3.5g/L，丙酮酸的最終濃度為4.0g/L。 第二，分別以果糖、木糖及混合糖為碳源對(duì)Escherichia coli lpdA<'->進(jìn)行游離培養(yǎng)，通過比較不同單糖及混合糖培養(yǎng)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了混合糖培養(yǎng)條件下，20g/L葡萄糖及果糖的混合糖、20g/L木糖及果糖的混合糖培養(yǎng)的丙酮酸的