枇杷丙酮酸激酶分子作用機(jī)制研究.pdf

1、丙酮酸激酶是催化糖酵解的最后一步不可逆終反應(yīng),在糖酵解途徑起著重要作用。本研究分離了枇杷丙酮酸激酶基因全長(zhǎng)序列,對(duì)其進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析,并研究了該基因及其編碼蛋白質(zhì)與果實(shí)糖積累的關(guān)系,構(gòu)建雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草,獲得了煙草轉(zhuǎn)基因植株,并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了鑒定,初步明確了枇杷丙酮酸激酶的功能。主要研究結(jié)果如下:
　　采用 RT-PCR及 RACE技術(shù)分離到枇杷丙酮酸激酶全長(zhǎng) cDNA序列,命名為EjPK。EjPK的長(zhǎng)度為1884 b

2、p,含有161 bp的5'UTR區(qū),193 bp的3'UTR區(qū)和1530 bp的編碼區(qū),共編碼510個(gè)氨基酸。序列分析顯示,EjPK的核酸序列和氨基酸序列與其他已經(jīng)報(bào)道的植物細(xì)胞質(zhì)丙酮酸激酶有78％—84%的相似性。EjPK屬于細(xì)胞質(zhì)丙酮酸激酶的一個(gè)分支,與葡萄、大豆、柑橘細(xì)胞質(zhì)丙酮酸激酶在系統(tǒng)進(jìn)化中親緣關(guān)系較近。
　　以 CaMV35S為啟動(dòng)子,將 EjPK的 ORF區(qū)連接到植物表達(dá)載體 pCAMBIA-1302的 GFP編碼區(qū)

3、的上游,構(gòu)建成含有 GFP的雙元表達(dá)載體。利用基因槍,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞。在激光共聚焦顯微鏡下觀察 GFP信號(hào),共聚焦成像的GFP熒光顯示,35S:EjPK-GFP融合蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中,細(xì)胞膜和細(xì)胞核中也有少量表達(dá),但質(zhì)體中沒有發(fā)現(xiàn)熒光信號(hào)。
　　利用 HPLC測(cè)定分析白沙(軟條白沙)和紅沙(寶珠)兩個(gè)不同枇杷品種不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的糖組成成分、不同時(shí)期各種糖類的含量和果實(shí)有機(jī)酸組分。結(jié)果表明,果實(shí)中糖有蔗糖、葡萄糖、果糖

4、和山梨醇,果糖和葡萄糖隨著果實(shí)的成熟而增加,蔗糖的含量變化波動(dòng)幅度小,山梨醇含量隨著果實(shí)成熟而減少。果實(shí)中有機(jī)酸的總量逐漸增加,后期有所下降。枇杷果實(shí)中的有機(jī)酸主要有蘋果酸、檸檬酸、奎寧酸、α-酮戊二酸、琥珀酸和草酰乙酸。
　　通過(guò)熒光定量 RT-PCR分析顯示,EjPK在枇杷的葉,根,莖,花,果實(shí)等中均有表達(dá)。在果實(shí)發(fā)育階段中,EjPK的表達(dá)在前期較低,后期水平顯著上升,之后隨著酸的消耗開始迅速下降。
　　通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法