版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
1、目的:
1.3-溴丙酮酸(3-Bromopyruvate,3-BrPA)抑制人鼻咽癌細胞HNE1和CNE-2Z細胞的增殖和誘導(dǎo)死亡的作用。
2.3-BrPA作用于人鼻咽癌細胞是否通過活性氧(ROS)水平的變化引起細胞程序性壞死。
方法:
1.人鼻咽癌細胞HNE1及CNE-2Z經(jīng)過藥物處理后采用MTT法檢測細胞存活率;集落克隆法檢測藥物處理后細胞集落形成情況;不同濃度的3-BrPA處理人鼻咽癌細胞
2、HNE1及 CNE-2Z5h,用腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)水平檢測試劑盒檢測。
2. PI單染法用流式細胞儀檢測3-BrPA(0,80,160,320μM)作用于人鼻咽癌細胞 HNE1及 CNE-2Z細胞死亡率。線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)檢測3-BrPA(0,40,80,160μM)作用于人鼻咽癌細胞 HNE1及CNE-2Z24 h后的細胞線粒體膜電位變化。
3.用Caspase抑制劑z-VAD-fmk(20
3、μM)或RIPK1抑制劑necrostatin-1(Nec-1,20μM)預(yù)處理人鼻咽癌細胞HNE1及CNE-2Z1h。預(yù)處理后,3-BrPA(160μM或320μM)聯(lián)合使用z-VAD-fmk(20μM)或Nec-1(20μM)。采用MTT法檢測存活率,來明確兩株細胞死亡形式;最后將HNE1和CNE-2Z用3-BrPA(160μM或320μM)處理后,用電鏡觀察細胞形態(tài)和細胞器的變化,進一步驗證兩株細胞HNE1和CNE-2Z的死亡形式
4、。
4. Western blot法檢測藥物處理人鼻咽癌細胞 HNE1及CNE-2Z對相關(guān)蛋白表達水平的影響。
5.人鼻咽癌細胞HNE1和CNE-2Z分別用3-BrPA(160μM或320μM)處理不同時間后,在細胞內(nèi)裝載超氧陰離子探針(DHE),采用流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)活性氧( ROS)的含量變化情況;并用活性氧抑制劑 N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC,5mM)預(yù)處理細胞1h,用NAC與
5、3-BrPA共同作用于細胞,繼而檢測細胞內(nèi)的ROS水平的變化。最后,3-BrPA聯(lián)合NAC處理細胞,使用 MTT法檢測細胞存活率。
6.在裸鼠體內(nèi)實驗中,建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型。檢測移植瘤的生長曲線, HE染色指標(biāo)觀察3-BrPA在體內(nèi)是否具有抑制腫瘤生長的效果。
結(jié)果:
1.3-BrPA對鼻咽癌細胞HNE1和CNE-2Z增殖的影響
1.1采用MTT法檢測,分析量效曲線可知在3-BrPA作用后人
6、鼻咽癌細胞HNE1和CNE-2Z的增殖可以明顯被抑制。并且隨著3-BrPA作用于細胞的時間延長和濃度的逐漸增加,細胞增殖抑制作用明顯增加。
1.2檢測3-BrPA對兩株細胞HNE1和CNE-2Z增殖作用的影響,首先根據(jù)細胞存活率實驗所得結(jié)果選用低于細胞IC50的藥物濃度,觀察集落形成數(shù)目。結(jié)果可以得出:低劑量濃度的3-BrPA對HNE1和CNE-2Z具有增殖抑制作用。
1.3檢測細胞內(nèi)ATP含量,由實驗結(jié)果顯示3-B
7、rPA(0,20,40,80,160,320μM)可以抑制鼻咽癌細胞內(nèi)的ATP生成。
2.3-BrPA誘導(dǎo)人鼻咽癌細胞死亡。
2.2用不同濃度的3-BrPA作用于人鼻咽癌細胞HNE1和CNE-2Z,PI單染法檢測結(jié)果顯示:隨著3-BrPA濃度增加,細胞死亡率增多。
2.3 DAPI熒光染色法檢測細胞核變化,結(jié)果顯示隨著3-BrPA濃度的增加細胞核呈現(xiàn)出濃縮致密,核裂現(xiàn)象逐漸增多。
3.3-BrPA
8、誘導(dǎo)線粒體膜電位發(fā)生變化。
3.1應(yīng)用熒光顯微鏡觀察JC-1染色后,人鼻咽癌細胞線粒體膜電位變化,給藥組同對照組的細胞相比較,可以觀察到紅色熒光逐漸向綠色熒光轉(zhuǎn)變。這表明細胞內(nèi)線粒體膜電位逐漸降低,細胞活性降低。
3.2通過Western blotting法檢測與有關(guān)蛋白 Mcl-1、Bcl-2、Bax及IAPs蛋白家族的變化,結(jié)果顯示:蛋白Mcl-1、Bcl-2以及IAPs蛋白家族CIAP1、 CIAP2、XIAP
9、表達減少,蛋白Bax的表達增多。
4. ROS產(chǎn)生在3-BrPA誘導(dǎo)的鼻咽癌細胞死亡中的作用。
4.1將兩株細胞用3-BrPA處理,在顯微下觀察得熒光強度??梢杂^察到細胞內(nèi)活性氧水平明顯升高。
4.2檢測細胞內(nèi)平均熒光強度采用流式細胞儀。同空白組相比,3-BrPA作用不同時間段后,可以觀察到隨著藥物作用時間延長細胞內(nèi)活性氧水平明顯增高。NAC和3-BrPA聯(lián)合用藥組細胞內(nèi)ROS水平?jīng)]有明顯升高。
10、4.3細胞存活率檢測實驗,結(jié)果表明NAC(5mM)可以抑制3-BrPA誘導(dǎo)的細胞死亡。表明3-BrPA是細胞內(nèi)ROS水平失衡而誘導(dǎo)的細胞死亡。
5.3-BrPA誘導(dǎo)鼻咽癌細胞產(chǎn)生程序性壞死。
5.1 Caspase抑制劑z-VAD-fmk(20μM)與3-BrPA聯(lián)合使用后,HNE1和CNE-2Z的細胞存活率不受影響,而與RIPK1抑制劑Nec-1合用時,則發(fā)現(xiàn)細胞存活率增加。
5.23-BrPA處理人鼻咽
11、癌HNE1和CNE-2Z后電鏡觀察細胞,發(fā)現(xiàn)3-BrPA組細胞器膨脹,細胞呈空泡狀,具有程序性壞死的特征。
6.3-BrPA在裸鼠體內(nèi)抗腫瘤效果
6.1檢測3-BrPA體內(nèi)抑制腫瘤生長的作用,采用人鼻咽癌 CNE-2Z異種移植瘤裸鼠模型。裸鼠腫瘤生長曲線表明:3-BrPA組的腫瘤生長曲線同空白組相比生長曲線平緩腫瘤體積較小,但效果略差于順鉑(DDP)組。蘇木精-伊紅染色法(HE染色)結(jié)果表明,3-BrPA給藥組與空白
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 3-溴丙酮酸對SMMC-7721和H22肝癌細胞的作用研究.pdf
- 3-溴丙酮酸對人宮頸癌HeLa細胞的抗腫瘤作用.pdf
- 三溴丙酮酸對PC3細胞生長的抑制作用.pdf
- Mcl-1在3-溴丙酮酸誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡敏感性中的作用.pdf
- 3-溴丙酮酸對秀麗隱桿線蟲毒性和代謝的研究.pdf
- 3-溴丙酮酸、檸檬酸鈉對胃癌細胞SGC-7901及裸鼠胃原位移植瘤的影響及作用機制研究.pdf
- 3-溴丙酮酸聯(lián)合順鉑抑制肺癌細胞株A549生長的實驗研究.pdf
- 糖酵解抑制劑3-溴丙酮酸刺激TNF-α自分泌誘導(dǎo)乳腺癌細胞壞死性凋亡的作用.pdf
- 3-溴丙酮酸聯(lián)合5-氟尿嘧啶對人結(jié)腸癌細胞周期阻滯及凋亡的影響.pdf
- 姜黃素對人鼻咽癌細胞放射增敏作用及其機制研究.pdf
- 3-溴丙酮酸誘導(dǎo)骨肉瘤細胞株MG63凋亡的實驗研究.pdf
- NGX6對鼻咽癌細胞的作用及機制研究.pdf
- 枇杷丙酮酸激酶分子作用機制研究.pdf
- 3-溴丙酮酸阻斷肝癌能量代謝的介入治療及其療效評價的實驗研究.pdf
- 丙酮酸乙酯對人胰腺癌細胞的抑制作用.pdf
- HMBA和桂皮酸對鼻咽癌細胞CNE2增殖抑制和凋亡的作用及其機制初探.pdf
- MiR-181c對耐順鉑鼻咽癌細胞凋亡的作用及其機制.pdf
- M2--型丙酮酸激酶對肝癌細胞增殖的影響.pdf
- 端粒酶正義寡核苷酸對鼻咽癌細胞生長的作用
- 丙酮酸乙酯對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的作用及其機制研究.pdf
評論
0/150
提交評論